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Biology

Caracterización de proteínas transmembrana de vesícula extracelular única mediante citometría de nanoflujo

Published: July 26, 2022
doi:
10.3791/64020
, , , , , , ,
1NanoFCM Co., Ltd, 2School of Sport, Exercise and Health Sciences,Loughborough University, 3Biomolecular Sciences Research Centre,Sheffield Hallam University

Summary

La última generación de herramientas de caracterización de EV es capaz de realizar un solo análisis de EV a través de múltiples parámetros simultáneamente. La citometría de nanoflujo mide todas las partículas biológicas mayores de 45 nm sin etiquetado e identifica características específicas de subpoblaciones mediante una variedad de técnicas de etiquetado fluorescente.

Abstract

La caracterización de partículas individuales se ha vuelto cada vez más relevante para la investigación de vesículas extracelulares, progresando desde técnicas de análisis a granel y análisis de partículas de primera generación hasta mediciones integrales de múltiples parámetros como la citometría de nanoflujo (nFCM). nFCM es una forma de citometría de flujo que utiliza instrumentación diseñada específicamente para el análisis de nanopartículas, lo que permite caracterizar miles de EV por minuto con y sin el uso de técnicas de tinción. La detección de dispersión lateral (SS) de alta resolución permite determinar el tamaño y la concentración para todas las partículas biológicas mayores de 45 nm, mientras que la detección simultánea de fluorescencia (FL) identifica la presencia de marcadores marcados y objetivos de interés. Las subpoblaciones marcadas pueden describirse en unidades cuantitativas de partículas/ml o como un porcentaje del total de partículas identificadas por dispersión lateral.

Aquí, los EV derivados de medios de cultivo celular condicionados (CCM) se marcan con un colorante lipídico, para identificar partículas con una membrana, y anticuerpos específicos para CD9, CD63 y CD81 como marcadores EV comunes. Las mediciones del material de comparación, un estándar de concentración y un estándar de tamaño de nanoesferas de sílice, así como el material de muestra etiquetado se analizan en un análisis de 1 minuto. El software se utiliza para medir el perfil de concentración y distribución de tamaño de todas las partículas, independientemente del etiquetado, antes de determinar las partículas que son positivas para cada una de las etiquetas.

La detección simultánea de SS y FL se puede utilizar de manera flexible con muchas fuentes diferentes de EV y objetivos de etiquetado, tanto externos como internos, que describen muestras de EV de manera exhaustiva y cuantitativa.

Introduction

¿Qué son los vehículos eléctricos?
Las vesículas extracelulares (EV) son el término colectivo para una gama de partículas membranosas derivadas de células integrales a muchas actividades celulares y tisulares normales. Su impacto en una amplia gama de campos científicos y su potencial relevancia clínica han impulsado un crecimiento en la investigación de EV y el interés industrial1. La investigación de EV pequeños (sEV) se centra principalmente en exosomas, partículas de 40-100 nm que comienzan la formación en los endosomas tempranos antes de la maduración y la liberación a través de la fusión de cuerpos multivesiculares (MVB) a la membrana plasmática, así como microvesículas, que brotan directamente de la membrana plasmática formando partículas de 80-1,000 nm2. Una tercera población de EV son cuerpos apoptóticos, partículas de 50-1.500 nm formadas durante la muerte celular, lo que significa que su proporción relativa a otros EV puede ser muy variable3.

Debido a que las características de EV pueden representar cambios que ocurren en su célula / tejido de origen, existe la posibilidad de su uso en el diagnóstico. Varios análisis “ómicos” han comenzado a identificar marcadores de origen celular y estado de enfermedad, lo que puede permitir la evaluación no invasiva de pacientes utilizando fuentes de EV como plasma sanguíneo / suero, orina, saliva y líquido cefalorraquídeo (LCR)4,5. Una fuerza impulsora detrás de estas innovaciones relacionadas con los vehículos eléctricos son las nuevas técnicas de caracterización que superan las limitaciones anteriores.

La necesidad y los desafíos de la caracterización de un solo EV
La caracterización de EV único es cada vez más importante tanto para la validación como para la descripción de aislados de EV, así como para dilucidar las características clave de estas nanopartículas para la progresión de terapias y diagnósticos basados en EV6. Dependiendo de la fuente de EV y el uso previsto, el análisis de pureza, a menudo descrito como una proporción de partículas EV a no EV o como EV a proteína libre, puede requerir cantidades significativas de datos de múltiples análisis7.

Las mediciones de conteo y tamaño de partículas en publicaciones EV se han basado previamente en gran medida en el seguimiento de nanopartículas (NTA), la detección de pulso resistivo (RPS) y la microscopía electrónica (EM)2. Los NTA y RPS estándar carecen de la capacidad de distinguir los EV de las partículas que no son EV y tienen sus propias advertencias, como el rendimiento lento8 y el límite inferior de detección inadecuado visto con NTA 9,10,11.

Las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81 han sido históricamente identificadores importantes de la presencia de EV en aislamientos/preparaciones de EV. Comúnmente, las técnicas de western blotting (WB) y dot blotting se utilizan para mostrar el enriquecimiento de estas proteínas en aislados de EV en comparación con el lisado celular12. Sin embargo, la falta de cuantificación de estos métodos y la heterogeneidad de estos marcadores de EV, tanto en lo que respecta a la visualización dentro de las subpoblaciones de EV como a la variación relacionada con células, tejidos o pacientes, alienta técnicas analíticas avanzadas, que unifican la caracterización física y fenotípica13.

Citometría de nanoflujo como técnica integral de análisis EV
La determinación de las verdaderas concentraciones de EV requiere la identificación de partículas intactas y un marcador universal, particularmente en aislados de partículas complejas, con una resolución capaz de detectar todos los EV y distinguirlos de las partículas no EV14.

La citometría de nanoflujo (nFCM) es una técnica que permite el análisis no marcado de partículas de tamaño entre 45-1.000 nm mientras se utiliza simultáneamente el etiquetado fluorescente y la detección para identificar subpoblaciones de partículas. Una distinción clave de la citometría de flujo convencional es el uso de equipos dedicados al análisis de nanopartículas, lo que permite la mayor resolución15. El análisis EV, que utiliza instrumentación de flujo convencional reutilizada para el análisis de partículas pequeñas, está mejorando, pero aún lucha por alcanzar la resolución para detectar y analizar EV de <100 nm16,17. La citometría de flujo basada en cuentas es una adaptación adicional a menudo empleada para el análisis EV, pero esto elimina la posibilidad de detección de partículas individuales e introduce sesgos basados en la captura18.

Beneficiándose de un límite inferior de detección de ~ 45 nm en el canal de dispersión lateral (SS) para el análisis EV, nFCM utiliza la activación SS. Esto puede considerarse como un análisis de “partículas primero”, ya que significa que los eventos deben proporcionar una señal SS, superando un umbral establecido antes del análisis de la intensidad de fluorescencia. Esto elimina falsos positivos, como agregaciones degradadas de membranas y fluoróforos, y enfoca el análisis en EV intactos15. Las mediciones de SS también se utilizan para dimensionar partículas individuales en comparación con un estándar de nanoesfera de sílice de cuatro modales19. Las mediciones de fluorescencia se toman en otros dos detectores que permiten tres mediciones simultáneas para cada partícula para describir la concentración de partículas, tamaños y presencia de marcadores u otros objetivos de interés con el fin de identificar subpoblaciones de EV20.

En el siguiente experimento, se utilizan mediciones de SS y fluorescentes (FL) para medir partículas de >45 nm, mostrar el subconjunto de EV positivos para membrana e identificar la presentación de CD9, CD63, CD81 en subpoblaciones de EV. Se describe tanto la concentración de estas subpoblaciones como su relación como parte del total de partículas medidas por SS, así como sus perfiles de tamaño.

Protocol

1. Configuración del instrumento nFCM y mediciones de los estándares nFCM NOTA: Se toman tres mediciones antes de comenzar la adquisición de datos para las muestras para validar la alineación correcta del instrumento nFCM y proporcionar una comparación sólida entre los instrumentos. Estos son el estándar de concentración / control de calidad (QC), el estándar de tamaño y un espacio en blanco. Diluir las perlas de control de calidad 1:100 en agua destilada en un tubo apropiado de 0,6 μL y colocarlas en el muelle de carga. En el menú desplegable Flujo de muestra, seleccione Boosting (Impulso) para introducir la muestra de control de calidad en el sistema durante 45 s y reemplazar completamente la muestra/solución de limpieza anterior.Mientras aumenta, ajuste la potencia del láser a la plantilla preestablecida para las perlas de control de calidad “250 nm FL QC standard”, por ejemplo, 10/40 mW para el láser azul, 20/50 mW para el láser rojo, con 0,2% de desintegración SS. Seleccione la presión de muestreo en el mismo menú hacia abajo para reducir la presión del sistema. Ajuste la presión de muestreo automático a 1,0 kPa para mantener una presión constante. Inicie el análisis de 1 minuto seleccionando Tiempo de registro en los controles de adquisición. Los datos se trazarán en el diagrama de puntos que muestra una escala logarítmica para la intensidad SS y una intensidad FL seleccionada. Inserte el nombre del archivo y la dilución de la muestra antes de guardar el archivo. Seleccione descargar para retirar el tubo del muelle de carga. Sustituir por 150 μL de solución limpiadora y limpiar durante >30 s seleccionando Impulsar antes de retirar la solución de limpieza seleccionando Descargar.Retire cualquier exceso de solución de limpieza de la punta capilar utilizando un tubo que contenga 150 μL de agua. Diluir las perlas de tamaño estándar 1:100 en agua y cargar 100 μL en el muelle de carga, antes de aumentar la muestra durante 45 s. Ajuste la potencia del láser a la plantilla preestablecida “S16 exo 68-155 nm”. Esta configuración es tanto para el tamaño estándar como para muestras que contienen EV < 200 nm. Por ejemplo, 15/40 mW para el láser azul, 20/50 mW para el láser rojo, con 0,2% de desintegración SS. Seleccione Muestreo y proceda a registrar la muestra durante 1 minuto como antes. Realice la tercera medición con una muestra de agua o PBS para crear una medición en blanco de su eluyente, identificando falsos positivos para su eliminación por parte del software. La introducción de las medidas estándar se describe en la siguiente sección. 2. Determinar la concentración de partículas de una muestra no etiquetada y generar un informe PDF Diluir la muestra EV no marcada en PBS a un rango de concentración de partículas adecuado para el análisis de nFCM, 1 x 10 8- 5 x 108 partículas/ml. Cargue 10-100 μL de la muestra diluida en el muelle de carga. Cuando se desconoce la concentración de partículas, comience con una dilución 1:100 de la muestra EV. La concentración de la muestra se puede aproximar rápidamente por el tamaño del punto láser en la cámara CCD durante el impulso, o por la observación del traza de ráfaga de eventos durante el muestreo. Aumente la muestra cargada durante 45 s antes de seleccionar Muestreo y grabe durante 1 minuto, guardando como se describió anteriormente. Para comenzar a analizar estos datos, cambie de la pestaña Adquisición a la pestaña Análisis . Abra los archivos nfa guardados. Para permitir una medición precisa de la muestra, utilice las dos mediciones estándar tomadas antes de la medición de la muestra para establecer los valores para la comparación de muestras, así como el espacio en blanco. Cree la curva estándar de tamaño, para la conversión de SS a diámetro, seleccionando primero el archivo estándar de tamaño y utilizando la herramienta establecer umbral (también conocida como umbral automático). El umbral, visible en el seguimiento de ráfaga de eventos, identifica la intensidad de señal mínima requerida para que un evento se considere significativo. Con el umbral establecido, compruebe que los parámetros del diagrama de puntos x e y son SS-H o SS-A en el eje x y FITC-A en el eje y. Abra la herramienta de generación de curvas estándar y seleccione S16 exo 68-155 nm como plantilla de tamaño. Haga clic en Buscar picos para identificar las intensidades SS máximas como una partícula de 68, 91, 113 o 155 nm de diámetro. Compruebe si la curva SS a diámetro se ha generado con un valor r cercano a 1 antes de cerrar la ventana. Establezca el estándar de concentración seleccionando el archivo guardado y haciendo clic en Count STD. Introduzca la concentración de partículas del patrón. Una vez establecida la información estándar, seleccione el archivo de muestra EV y establezca el umbral. Seleccione el archivo en blanco y haga clic en Establecer en blanco para identificar el número de falsos positivos para su eliminación del recuento de muestras. Esto debe hacerse con el mismo umbral que su muestra. Vuelva al archivo de ejemplo EV. Abra la herramienta de generación de PDF y seleccione Tamaño y concentración. Introduzca las diluciones de la muestra. Se muestra la concentración de la muestra y la distribución del tamaño de las partículas. 3. Etiquetado de muestras NOTA: Se pueden utilizar dos estrategias de tinción simultáneamente para un análisis exhaustivo de las partículas en suspensión. Los protocolos de etiquetado a menudo requieren la optimización de nuevos anticuerpos o fuentes de muestras. Diluir una porción de la muestra EV a una concentración de 1.25 x 1010 partículas/mL en PBS. Incubar 8 μL de la muestra EV diluida con 1 μL de anticuerpo y 1 μL de colorante para una concentración de partículas de 1 x 10 10 partículas/ml (las partículas totales serán 1 x 108 suspendidas en10 μL). La relación de incubación para el anticuerpo es 1:50 (1 μL de anticuerpo 1:5) en este caso.Utilice más de tres concentraciones diferentes de anticuerpos o colorantes durante la optimización, para proporcionar datos que indiquen que el protocolo permite la unión máxima del epítopo sin sobresaturación de la etiqueta elegida, lo que puede afectar la identificación de eventos de fluorescencia de baja intensidad. La concentración de incubación para el colorante de membrana es de 40 nM (1 μL de 400 nM). Mezclar la muestra de 10 μL mediante vórtice durante 5 s e incubar a RT durante 30 minutos en la oscuridad.NOTA: Las recomendaciones para los controles se incluyen en la discusión. Después de la incubación, tomar 1 μL de la muestra marcada y diluir 1:50 en PBS en un tubo de 0,6 ml. Cargue la muestra en el muelle de carga y aplique presión de refuerzo durante 45 s. Asegúrese de que los ajustes del láser sean correctos y de que se carguen las lentes adecuadas. Cambie a presión de muestreo y seleccione Tiempo para grabar. Después de la adquisición de 1 minuto, asigne un nombre al archivo de datos y guárdelo. Descargue la muestra y reemplácela con solución de limpieza. Aumente esto durante >30 s antes de cargar la siguiente muestra etiquetada. 4. Análisis nFCM-Generación de PDF para análisis de subpoblaciones Para la generación de PDF, aplique los mismos estándares que se hicieron anteriormente; Solo la medida en blanco se establecerá de manera diferente. Seleccione el archivo de ejemplo y establezca el umbral. En el diagrama de puntos, cambie el eje y para mostrar las mediciones FL del canal verde o rojo. Seleccione la herramienta de acceso cuadrado y use el clic izquierdo para dibujar un cuadrado alrededor de la población FL+. Abra el archivo de medición en blanco y haga clic en Establecer en blanco antes de volver al archivo de muestra. Abra la herramienta de generación de PDF como antes y se identificarán la distribución de tamaño, la concentración y el porcentaje (en comparación con todos los eventos SS+) para la subpoblación FL+.Repita para cada subpoblación de interés identificada como “Total, P1, P2, etc.”

Representative Results

Presentación de tetraspanina en vehículos eléctricos derivados de SW620 y vehículos eléctricos derivados de C2C12El análisis moderno de la abundancia de tetraspaninas clave CD9, CD63 y CD81 en EVs de una variedad de fuentes ha puesto de relieve la extrema variabilidad de su presencia, tanto en análisis a granel como al analizar su presentación en subpoblaciones de EV21. Esto probablemente está relacionado con la disponibilidad de diferentes vías de biogénesis, como las vías dependientes e independientes de ESCRT22. CD9 se presentó en el mayor porcentaje de C2C12 EV en ~ 50%, con la presentación de CD63 en solo ~ 30%, en la Figura 1. Cuando se realizó el etiquetado con las tres antitetraspaninas en una incubación, se demostró que ~ 70% de las partículas presentaban al menos uno de los marcadores EV. Las mediciones repetidas mostraron la desviación estándar más baja para el etiquetado CD9/63/81 de los EV C2C12 en ~ 3.8%, mientras que esto fue ~ 8.1% para los EV C2C12 etiquetados con CD81. Los EV derivados de SW620 mostraron un perfil de tetraspanina diferente, con una diferencia mucho mayor entre el CD9 más presentado a ~ 40% y el CD63 menos presentado a ~ 7%. Similar a los EV C2C12, CD9 estaba presente en la mayoría de la población positiva para tetraspanina, ya que el etiquetado combinado CD9/63/81 identificó ~ 42% de partículas que tenían al menos uno de los tres marcadores. La mayoría de las partículas derivadas de C2C12, la población total de SS+, variaron en tamaño de 45-120 nm, con una mediana de ~65 nm de diámetro. Los perfiles de tamaño para cada una de las subpoblaciones EV marcadas con tetraspanina única, que se muestran en la Figura 1, son similares entre sí, mostrando un tamaño mediano más grande de ~ 75-85 nm y menos EV de <65 nm en comparación con la población total de partículas. Las partículas derivadas de SW620 oscilaron entre 45-160 nm con un tamaño medio de ~ 65 nm, mostrando una distribución sesgada. Los EV marcados con tetraspanina muestran una distribución más normal y un diámetro mediano más grande entre 90-110 nm, con distribuciones similares entre subpoblaciones individuales positivas para tetraspanina. Si bien las tetraspaninas más y menos presentadas son las mismas para estas dos líneas celulares, su representación proporcional difiere mucho y existe una diferencia interesante entre la posible copresentación de tetraspaninas observable a partir de la diferencia en la positividad de CD9 y la positividad CD9/63/81. Combinación del etiquetado de membrana EV con el etiquetado de anticuerposLa membrana bicapa de los EV proporciona un objetivo de etiquetado más genérico, que puede permitir la distinción de partículas no EV de tamaño similar, como agregados de proteínas y algunas formas de LDL con monocapas lipídicas23. La especificidad de este tipo de etiquetado debe validarse, ya que se ha demostrado que algunos colorantes de membrana comunes utilizados en la investigación de EV también se unen a partículas que no son EV24. El etiquetado de membrana mostró repetidamente ~ 80% de positividad de EV derivados de C2C12 y SW620 EV. La intensidad SS (SS-H) muestra una buena correlación con la intensidad de FITC en los diagramas de puntos de los resultados de C2C12 y SW620 que se muestran en la Figura 2. Esto se espera ya que la intensidad SS es relativa al tamaño de partícula y, por lo tanto, al área de superficie de la membrana. La mayoría de los EV marcados con anticuerpos también fueron positivos para el marcado de membrana mostrando porcentajes positivos dobles (FITC + y APC +) muy similares a los porcentajes positivos de tetraspanina. Los diagramas de puntos FITC vs APC muestran una ligera correlación entre el marcado de membrana y tetraspanina con el etiquetado de CD63 que parece mostrar la correlación más débil con el etiquetado de membrana. Se detectaron pocos eventos que fueran positivos para el etiquetado de anticuerpos pero negativos para el marcado de membrana. Reproducibilidad, eficiencia de etiquetado dual y salidas de datos alternativasUna consideración importante en el diseño de experimentos nFCM es la interactividad fluorófora o de etiquetas. La Figura 3a muestra que repetir el etiquetado de anticuerpos con y sin etiquetado adicional de membrana conduce a mediciones de % de positividad muy similares. En particular, el etiquetado SW620 muestra muy poca variación entre los dos conjuntos de medición. Esto muestra una interferencia limitada entre el tinte y la unión de anticuerpos y también resalta la buena reproducibilidad al repetir el etiquetado EV. Las mediciones de intensidad, tanto la dispersión lateral como la fluorescencia, se pueden exportar para sobresalir para cada partícula individual medida. A partir de esto, podemos generar mediciones de intensidad de fluorescencia media (MFI) para proporcionar aproximaciones comparativas de la abundancia de nuestro objetivo marcado. MFI para las poblaciones fluorescentes de EV derivados de C2C12 sugiere una presentación ligeramente menor de CD63 y CD81 con mediciones de MFI de ~ 550 y ~ 600, respectivamente, en comparación con ~ 850 MFI observadas para CD9 + EV. Las unidades de medida para MFI en este caso son FL-A y no están estandarizadas contra una calibración fluorescente. El uso de los tres anticuerpos no provoca una fluorescencia mucho mayor que el etiquetado de CD9. Esto es muy diferente a las mediciones de SW620 MFI, que sugieren que el uso de un cóctel de los tres anticuerpos proporciona una mayor señal de fluorescencia para los EV marcados, que el uso de cualquier etiqueta de anticuerpos individual. Los histogramas de distribución de tamaño producidos por el software NanoFCM también se pueden exportar a Excel, lo que permite superponer conjuntos de datos triplicados. Los perfiles de distribuciones de tamaño de la figura 3 son similares a los de la figura 1 , pero incluyen barras de error. El tamaño medio de EV de las subpoblaciones positivas de tetraspanina en EV derivadas de C2C12 muestra una mediana de alrededor de 70 nm, ligeramente mayor que el promedio de 60 nm de las poblaciones totales de partículas. Los EV SW620 positivos para marcadores de tetraspanina son más grandes, mostrando picos a ~ 100 nm. Figura 1: Subpoblaciones de EV CD9, CD63, CD81 positivas identificadas por el etiquetado de anticuerpos . (A) Gráfico de barras que muestra el porcentaje de EV marcados en comparación con el total de partículas observadas por SS para EV derivadas de C2C12. (B) Gráfico de barras que muestra el porcentaje de EV marcados en comparación con el total de partículas observadas por SS para EV derivados de SW620. (C) Perfiles representativos de distribución de tamaño para vehículos eléctricos derivados de C2C12. Cada histograma se toma de los PDF generados para la primera medición de conjuntos de datos triplicados. (D) Perfiles representativos de distribución de tamaño para vehículos eléctricos derivados de SW620. Cada histograma se toma de los PDF generados para la primera medición de conjuntos de datos triplicados. Las barras de error representan la desviación estándar de las mediciones triplicadas de las mismas muestras etiquetadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Marcaje de membrana y anticuerpo de subpoblaciones de EV que presentan CD9, CD63, CD81 . (A) Gráfico de barras que muestra Membrana+ %, tetraspanina+ % y doble+ % para los EV C2C12. (B) Gráfico de barras que muestra Membrana + %, tetraspanina + % y doble + % para SW620 EV. (C) Diagramas de puntos representativos de SS vs FITC que muestran la puerta cerrada para la población positiva para la membrana. (D) Diagramas de puntos representativos de FITC vs APC que muestran la activación para la población doble positiva de vehículos eléctricos de C2C12. (E) Diagramas de puntos representativos de FITC vs APC que muestran la activación de la población doble positiva de vehículos eléctricos de SW620. Las barras de error representan la desviación estándar de las mediciones triplicadas de las mismas muestras etiquetadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Evaluación de la variación en las mediciones repetidas . (A) Gráficos de barras que muestran el porcentaje de positividad del etiquetado de anticuerpos con y sin etiquetado de membrana adicional. (B) Mediciones de intensidad de fluorescencia media para subconjuntos de EV cerrados. (C) Histogramas de distribución de tamaño promedio para conjuntos de datos triplicados para EV C2C12. (D) Histogramas de distribución de tamaño promedio para conjuntos de datos triplicados para vehículos eléctricos SW620. Las barras de error representan la desviación estándar de las mediciones triplicadas de las mismas muestras etiquetadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Detalles de la muestra y del reactivo
Se seleccionaron dos aislados de EV de líneas celulares separadas para la demostración del marcado fluorescente y el posterior análisis de nFCM. Ambos conjuntos EV se suspendieron en PBS y se almacenaron a -80 ° C durante <3 meses, pero la mayoría de las otras condiciones fueron diferentes entre los aislados. La línea celular de mioblastos de ratón C2C12 representa un precursor embrionario de las células del músculo esquelético y se cultivó en cultivo 2D, acondicionando el medio de crecimiento durante 72 h antes del aislamiento EV por ultracentrifugación. SW620 es una línea celular de adenocarcinoma de colon humano y se cultivó en un biorreactor rudimentario, enriqueciendo medios durante 7 semanas, con aislamiento EV realizado por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y fracciones 7-9 eluidas de columnas CL-2B de sefarosa combinadas en una sola muestra.

Si bien los EV aislados y concentrados de CCM son los tipos de muestra más fáciles de trabajar, nFCM es aplicable a la mayoría de los aislados de EV, incluidos los biofluidos como suero, plasma, orina y LCR. Estos análisis de muestras se benefician de la detección de nFCM SS de todas las partículas, lo que permite la corroboración con NTA, TRPS y otros análisis de partículas, al tiempo que describen las subpoblaciones de EV marcadas con fluorescencia en términos cuantitativos, así como una proporción del total, para un enfoque imparcial del análisis de partículas multiparamétricas. También es posible el análisis de muestras poco procesadas, como orina no aclarada y CCM enriquecido con EV con la advertencia de requerir proteínas poco contaminantes.

El colorante de membrana utilizado aquí está destinado a integrarse en la bicapa lipídica, con una fracción lipofílica para la carga de la membrana y un colorante hidrófilo para permanecer en la membrana plasmática25. Actualmente no existe un tinte perfecto para el etiquetado de EV y se deben considerar varios criterios al elegir, incluida la especificidad de los EV, la idoneidad con la fijación o permeabilización y la eficiencia del etiquetado EV26.

El marcado de anticuerpos conjugados fluorescentes de epítopos expuestos superficialmente ha demostrado ser un método eficaz para identificar subpoblaciones de EV27. Un aspecto clave de la optimización del protocolo es cumplir, y no exceder, el punto de saturación del etiquetado para unirse a todos los epítopos disponibles sin inhibir la detección de partículas de baja fluorescencia al permitir que el tampón circundante se llene con anticuerpos fluorescentes no unidos28. Además, la disponibilidad de sitios de unión expuestos para el etiquetado de anticuerpos está potencialmente influenciada por varios factores. Se ha demostrado que las condiciones de almacenamiento de los EV afectan los perfiles de concentración y tamaño de los EV29 , y las observaciones también indican efectos en el etiquetado de anticuerpos30. La presencia de proteínas corona de superficie, modificaciones de proteínas e impactos de las técnicas de aislamiento también pueden tener efectos sobre el etiquetado de anticuerpos en algunos casos. En última instancia, a medida que la utilización del etiquetado fluorescente se vuelve más frecuente para los estudios de EV, el diseño experimental y la optimización de múltiples técnicas analíticas se volverán más refinados.

Para aumentar la precisión de los resultados, se pueden incluir varios controles, como (1) PBS + control de colorante, para evaluar la formación de micelas o agregados en algunos colorantes, que pueden aparecer como partículas SS + en el análisis de nFCM, (2) PBS + control de anticuerpos, pueden ocurrir agregados, aunque a menudo no lo suficientemente grandes como para dispersar suficiente luz para la detección de SS, (3) muestra EV + control de anticuerpos IgG, común en citometría de flujo y utilizado para identificar cualquier unión no específica, (4) muestra de partículas no EV + control de anticuerpos / colorantes: particularmente importante cuando se necesita identificar EV en muestras de partículas complejas, controles como partículas purificadas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) o muestras agotadas / ablacionadas de EV pueden actuar como un control negativo para validar el etiquetado selectivo, (5) los controles positivos son difíciles de diseñar, pero la validación de un anticuerpo en las células es una inclusión útil.

Presentación de tetraspaninas en EVs
El etiquetado de anticuerpos y membranas de este experimento demuestra el alto nivel de datos cuantitativos que se pueden obtener en un corto período de tiempo mediante el análisis nFCM. La medición simultánea de los atributos físicos clave del diámetro/concentración de partículas con las mediciones fenotípicas de la presencia de membrana y/o proteínas conduce a descripciones de alto nivel de subpoblaciones dentro del aislamiento de partículas.

Es importante destacar que se identificaron niveles variables de las tres tetraspaninas “clave” relacionadas con EV, CD9, CD63, CD81, en estas dos muestras de EV. CD9 se presentó en la mayor proporción de EV tanto para EV derivados de C2C12 como para SW620, siendo CD81 y CD63 las segundas y menos presentadas proteínas, respectivamente.

A pesar de algunas similitudes observadas aquí en los perfiles de tetraspanina de EVs de dos fuentes celulares muy diferentes, los niveles de CD9, CD63 y CD81 pueden ser muy diferentes entre la línea celular y las EVs derivadas del paciente31.

La diferencia en la expresión de CD63 entre las dos muestras de EV es particularmente relevante para la discusión en curso de los identificadores clave de “EV-ness”. Si bien la presentación de CD63 en solo ~ 8% de los EV SW620 puede ser inesperada para algunos, CD63 se ha sugerido como un identificador deficiente de los diferentes tipos de EV aislados por tamaño o densidad32, y se han identificado EV negativos para tetraspanina, incluso cuando se describen como exosomas33.

Identificación de vehículos eléctricos dentro de aislamientos de partículas complejas
La heterogeneidad de los perfiles de tetraspanina EV, tanto en EV de línea celular como en EV derivadas de pacientes, advierte contra la dependencia de la captura de EV basada en tetraspanina y destaca la necesidad futura de nuevos métodos de identificación de EV31. El etiquetado de EV independiente de proteínas específicas podría resultar altamente beneficioso para identificar EV a partir de partículas no EV de tamaño similar si se puede demostrar que la especificidad de EV es muy alta. Esto es particularmente cierto para los aislados de EV de biofluidos, ya que se ha sugerido que la concentración de EV en el plasma sanguíneo humano está en el rango de 10 10 partículas / ml, mientras que las lipoproteínas se miden en 1016 por ml14,34. Incluso tras el enriquecimiento de EV, los estudios que comparan la positividad de partículas para marcadores de tetraspanina y / o marcador LDL ApoB sugieren ~ 50-100 veces mayor abundancia de LDL en muestras de plasma libre de plaquetas (PFP) en comparación con EV35.

La técnica de aislamiento utilizada afecta en gran medida el rango de partículas no EV coaisladas, como las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) y LDL36. También hay descripciones de coaislados de lipoproteínas unidas a EV que, aunque potencialmente desempeñan un papel biológico importante, hacen que lograr muestras puras de EV sea un objetivo desafiante35.

Por lo tanto, se podría argumentar que se debe poner un mayor énfasis en la descripción de las partículas que componen una muestra, en lugar de lograr el aislamiento de una selección pura pero limitada de EV. Lograr una descripción completa de las partículas midiendo la abundancia de tetraspanina a granel y los recuentos de partículas por separado puede ser insuficiente para determinar con precisión las concentraciones de EV, particularmente de fuentes de biofluidos36,37. La identificación de subpoblaciones en un enfoque basado en niveles, mostrando partículas totales, EV y EV que presentan ciertas proteínas, como se demostró en este experimento, puede proporcionar una solución robusta para la caracterización de nanopartículas. Este ha sido el caso de proyectos que involucran carga EV con diseños para futuras aplicaciones terapéuticas20 e identificación de EV CD63+ con carga luminal como las mitocondrias38.

nFCM dentro del repertorio de analítica EV
Una fortaleza del análisis de EV nFCM es la forma en que los datos pueden corroborar y construir sobre los análisis EV más comunes y formar puentes entre conjuntos de datos físicos y fenotípicos. Sin embargo, esto se basa en protocolos de etiquetado precisos que a menudo deben optimizarse para reactivos de etiquetado únicos, como colorantes y anticuerpos. Un criterio clave para un análisis preciso es tener partículas marcadas suspendidas en un tampón no fluorescente, que se basa en la eliminación del exceso de fluoróforo no unido o en el refinamiento de los protocolos para no exceder la saturación de epítopos.

Los estudios de comparación han demostrado que el tamaño nFCM de los EV proporciona datos en línea con TRPS y crio-TEM, técnicas que se describen como más precisas que NTA para el análisis del tamaño de EV10,39. Sin embargo, como con cualquier método basado en óptica, la influencia de las propiedades ópticas heterogéneas observadas para los EV y las diferencias entre las propiedades ópticas del material de referencia y los EV deben reconocerse al interpretar los datos10.

El Western blot ha sido un método clave para indicar el enriquecimiento de EV a través de la identificación de marcadores EV40. Pero el deseo de demostrar la presencia de tales marcadores en las partículas ha impulsado avances en los análisis citométricos de flujo basados en EV17. Sin embargo, las resoluciones necesarias para proporcionar datos sólidos se logran actualmente mejor a través de instrumentación dedicada con respecto a la luz dispersa y fluorescente19.

nFCM proporciona un enfoque imparcial de describir inicialmente todas las partículas irrelevantes de marcadores específicos, mediante el uso de la medición de dispersión lateral, lo que permite la corroboración con las técnicas más comunes de NTA, RPS y TEM1, al tiempo que agrega mediciones fenotípicas similares a WB o Elisa de manera cuantitativa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a los grupos de Owen Davies y Nick Peake por continuar proporcionando material y experiencia.

Materials

APC Anti-CD81 antibody (M38) abcam ab233259 Anti-Human CD81 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) Abcam ab82392 Anti-mouse CD9 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted abcam ab82389 Anti-Human CD9 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse CD63 antibody biolegend 143905 Anti-Mouse CD63 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse/rat CD81 antibody biolegend 104909 Anti-Mouse CD81 APC
conjugated antibody
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC invitrogen Via Fisherscientific A15712 Anti-Human CD63 APC
conjugated antibody
Celline AD1000 bioreactor Merck Z688037-5EA
Cleaning solution NanoFCM 17159 In house cleaning solution for nanoanalyser
EVs from C2C12 Gifted Mouse line
EVs from SW620 Gifted Human line
Memglow – Fluorogenic Membrane Probe Cytoskeleton MG01 non toxic cell membrane dye
NanoAnalyzer NanoFCM nano-flow cytometer for measurement of single particles
PBS, pH 7.2 Gibco Via Fisherscientific 12549079 Salt solution for dilution of samples and antibodies
Snaplock Microtubes, 0.60mL Axygen Via Fisherscientific 11371944 Tubes required to load sample into nanoanalyser
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References

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Single Extracellular VesicleTransmembrane ProteinNano-flow CytometryEV CharacterizationParticle AnalysisLabel-free DetectionFluorescence DetectionVesicle SubpopulationsPlasmaCSFCell CultureVirusesLipid NanoparticlesNanomaterialsLabeling ProtocolQC BeadsPressure ControlSample DilutionCleaning SolutionSize Standard Beads

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Lees, R., Tempest, R., Law, A., Aubert, D., Davies, O. G., Williams, S., Peake, N., Peacock, B. Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (185), e64020, doi:10.3791/64020 (2022).
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