ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

サンプルと試薬の詳細
別々の細胞株からの2つのEV分離株を、蛍光標識とその後のnFCM分析のデモンストレーションのために選択しました。両方のEVセットをPBSに懸濁し、-80°Cで<3か月間保存しましたが、他のほとんどの条件は分離株間で異なっていました。C2C12マウス筋芽細胞株は、骨格筋細胞の胚前駆体を表し、2D培養で増殖させ、超遠心分離によるEV単離の72時間前に増殖培地をコンディショニングしました。SW620はヒト結腸腺癌細胞株であり、初歩的なバイオリアクターで増殖し、培地を7週間にわたって濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)およびセファロースCL-2Bカラムから溶出した画分7〜9を単一のサンプルに結合してEV単離しました。

CCMから分離および濃縮されたEVは最も扱いやすいサンプルタイプですが、nFCMは、血清、血漿、尿、CSFなどの生体液を含むほとんどのEV分離株に適用できます。これらのサンプル分析は、すべての粒子のnFCM SS検出の恩恵を受け、NTA、TRPS、およびその他の粒子分析との裏付けを可能にしながら、蛍光標識されたEV亜集団を定量的および全体の割合で記述し、マルチパラメータ粒子分析の公平なアプローチを実現します。未清澄尿やEV濃縮CCMなど、低処理サンプルの分析も可能ですが、低汚染タンパク質が必要であるという警告があります。

ここで用いられる膜色素は、脂質二重層に一体化するものであり、膜装填のための親油性部分と、原形質膜²⁵中に残存するための親水性色素とを有する。現在、完璧なEVラベリング色素はなく、EVへの特異性、固定または透過処理への適合性、EVラベリングの効率など、いくつかの基準を考慮する必要があります²⁶。

表面露出エピトープの蛍光標識抗体標識は、EV亜集団を同定するための有効な方法であることが証明されています²⁷。プロトコル最適化の重要な側面は、周囲のバッファーを蛍光未結合抗体で満たすことを可能にすることにより、低蛍光粒子の検出を阻害することなく、利用可能なすべてのエピトープに結合する標識飽和点を満たし、超えないことです²⁸。さらに、抗体標識のための露出した結合部位の利用可能性は、いくつかの要因の影響を受ける可能性があります。EVの保管条件は、EVの濃度およびサイズプロファイルに影響を与えることが示されており^、 観察結果は抗体標識³⁰への影響も示しています。表面コロナタンパク質の存在、タンパク質修飾、および分離技術の影響も、場合によっては抗体標識に影響を与える可能性があります。最終的に、EV研究で蛍光標識の利用が普及するにつれて、複数の分析技術の実験デザインと最適化がより洗練されるでしょう。

結果の精度を高めるために、(1)PBS +色素コントロール、nFCM分析でSS +粒子として現れる可能性のある一部の色素におけるミセルまたは凝集体形成を評価する、(2)PBS +抗体コントロール、凝集体が発生する可能性がありますが、SS検出に十分な光を散乱させるのに十分な大きさではないことがよくあります。 (3)EVサンプル+ IgG抗体コントロール、 フローサイトメトリーで一般的で、非特異的結合の同定に使用される、(4)非EV粒子サンプル+抗体/色素コントロール-複雑な粒子サンプル、精製低密度リポタンパク質(LDL)粒子やEV枯渇/アブレーションサンプルなどのコントロールは、選択的標識を検証するためのネガティブコントロールとして機能する可能性がある、(5)ポジティブコントロールは設計が難しいが、細胞上の抗体の検証は有用なインクルージョンです。

EVでのテトラスパニンのプレゼンテーション
この実験の抗体およびメンブレン標識は、nFCM分析によって短い時間枠で取得できる高レベルの定量データを実証しています。粒子径/濃度の主要な物理的特性を膜および/またはタンパク質の存在の表現型測定と同時に測定することで、粒子分離内の亜集団の高レベルの記述が可能になります。

重要なことに、これら2つのEVサンプルでは、3つの「重要な」EV関連テトラスパニン、CD9、CD63、CD81のさまざまなレベルが同定されました。CD9は、C2C12由来のEVとSW620の両方でEVの最大の割合で提示され、CD81とCD63はそれぞれ2番目と最も提示されていないタンパク質でした。

2つの非常に異なる細胞源からのEVのテトラスパニンプロファイルでここで観察されたいくつかの類似性にもかかわらず、CD9、CD63、およびCD81のレベルは、細胞株と患者由来のEVの間で非常に異なる可能性があります³¹。

2つのEVサンプル間のCD63発現の違いは、「EVらしさ」の主要な識別子に関する進行中の議論に特に関連しています。SW620 EVのわずか~8%にCD63が発現することは予想外かもしれませんが、CD63はサイズまたは密度によって分離された異なるタイプのEVの識別不良として示唆されており³²、テトラスパニン陰性EVは、エキソソーム様と記載されている場合でも同定されています³³。

複合粒子分離におけるEVの同定
細胞株EVと患者由来EVの両方におけるEVテトラスパニンプロファイルの不均一性は、テトラスパニンベースのEV捕捉への依存に対する警告であり、新しいEV同定方法の将来の必要性を強調しています³¹。特定のタンパク質に依存しないEV標識は、EV特異性が非常に高いことが証明されれば、同様のサイズの非EV粒子からEVを同定するのに非常に有益であることが証明される可能性があります。これは、ヒト血漿中のEVの濃度が10¹⁰粒子/ mLの範囲にあるのに対し、リポタンパク質は10¹⁶ / mL ^14,34で測定されることが示唆されているため、生体流体EV分離物に特に当てはまります。EV濃縮時でさえ、テトラスパニンマーカーおよび/またはLDLマーカーApoBの粒子陽性を比較する研究は、^EV35と比較して、無血小板血漿(PFP)サンプル中のLDLの存在量が~50~100倍多いことを示唆しています。

使用される単離技術は、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中密度リポタンパク質(IDL)、LDL³⁶などの共単離された非EV粒子の範囲に大きく影響します。EVに結合したリポタンパク質共単離物の説明もあり、重要な生物学的役割を果たす可能性がある一方で、EVの純粋なサンプルを達成することは困難な目標³⁵です。

したがって、純粋ではあるが限られたEVの選択を分離することよりも、サンプルを構成する粒子の記述に重点を置くべきであると主張することができます。テトラスパニンの存在量をバルクで測定し、粒子数を別々に測定することによって粒子の包括的な記述を達成することは、特に生体流体源からのEV濃度を正確に決定するには不十分である可能性があります^36,37。この実験で実証されているように、層ベースのアプローチで亜集団を特定し、特定のタンパク質を提示する全粒子、EV、およびEVを示すことは、ナノ粒子の特性評価に対する堅牢なソリューションを提供する可能性があります。これは、将来の治療用途²⁰の設計を伴うEV搭載や、ミトコンドリア³⁸などの管腔貨物によるCD63+ EVの同定を含むプロジェクトに当てはまります。

EV分析のレパートリー内のnFCM
nFCM EV分析の強みは、データが最も一般的なEV分析を裏付けて構築し、物理データセットと表現型データセットの間にブリッジを形成する方法です。ただし、これは正確な標識プロトコルに基づいており、多くの場合、色素や抗体などの独自の標識試薬用に最適化する必要があります。正確な分析のための重要な基準は、標識粒子を非蛍光バッファーに懸濁させることであり、これは過剰な未結合蛍光色素の除去またはエピトープ飽和を超えないようにプロトコルを改良することに依存します。

比較研究では、EVのnFCMサイジングは、EVサイズ分析においてNTAよりも正確であると説明されているTRPSおよびクライオTEMに沿ったデータを提供することが示されています^10,39。しかし、他の光学ベースの方法と同様に、データを解釈する際には、EVに見られる不均一な光学特性の影響、および標準物質とEVの光学特性の違いを認める必要があります¹⁰。

ウェスタンブロッティングは、EV^{マーカー40}の同定を通じてEV濃縮を示すための重要な方法である。しかし、粒子上のそのようなマーカーの存在を実証したいという願望は、EVベースのフローサイトメトリー分析の進歩を推進しました¹⁷。ただし、堅牢なデータを提供するために必要な解像度は、現在、散乱光と蛍光灯の両方に関して専用の機器によって最もよく達成されています¹⁹。

nFCMは、側方散乱測定を使用して、特定のマーカーに関係のないすべての粒子を最初に記述する公平なアプローチを提供し、NTA、RPS、およびTEM¹の最も一般的な手法による裏付けを可能にすると同時に、WBまたはElisaと同様の表現型測定を定量的に追加します。