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Caracterização da Proteína Transmembrana da Vesícula Extracelular Única por Citometria de Nanofluxo

Published: July 26, 2022
doi:
10.3791/64020
, , , , , , ,
1NanoFCM Co., Ltd, 2School of Sport, Exercise and Health Sciences,Loughborough University, 3Biomolecular Sciences Research Centre,Sheffield Hallam University

Summary

A última geração de ferramentas de caracterização de EV é capaz de uma única análise de EV em vários parâmetros simultaneamente. A citometria de nanofluxo mede todas as partículas biológicas maiores que 45 nm sem marcação e identifica características específicas de subpopulações por uma variedade de técnicas de marcação fluorescente.

Abstract

A caracterização de partículas únicas tornou-se cada vez mais relevante para a pesquisa de vesículas extracelulares, progredindo de técnicas de análise a granel e análise de partículas de primeira geração para medições multiparâmetros abrangentes, como a citometria de nanofluxo (nFCM). O nFCM é uma forma de citometria de fluxo que utiliza instrumentação projetada especificamente para análise de nanopartículas, permitindo que milhares de EVs sejam caracterizados por minuto com e sem o uso de técnicas de coloração. A detecção de dispersão lateral (SS) de alta resolução permite que o tamanho e a concentração sejam determinados para todas as partículas biológicas maiores que 45 nm, enquanto a detecção simultânea de fluorescência (FL) identifica a presença de marcadores marcados e alvos de interesse. As subpopulações marcadas podem então ser descritas em unidades quantitativas de partículas/mL ou como uma porcentagem do total de partículas identificadas por dispersão lateral.

Aqui, os EVs derivados de meios de cultura de células condicionadas (CCM) são marcados com um corante lipídico, para identificar partículas com uma membrana, e anticorpos específicos para CD9, CD63 e CD81 como marcadores comuns de EV. Medições de material de comparação, um padrão de concentração e um padrão de tamanho de nanoesferas de sílica, bem como material de amostra marcado são analisados em uma análise de 1 minuto. O software é então usado para medir o perfil de distribuição de concentração e tamanho de todas as partículas, independentemente da rotulagem, antes de determinar as partículas que são positivas para cada um dos rótulos.

A detecção simultânea de SS e FL pode ser utilizada de forma flexível com muitas fontes e alvos de rotulagem de EV diferentes, externos e internos, descrevendo amostras de EV de maneira abrangente e quantitativa.

Introduction

O que são VEs?
Vesículas extracelulares (EVs) são o termo coletivo para uma gama de partículas membranosas derivadas de células integrantes de muitas atividades celulares e teciduais normais. Seu impacto em uma ampla gama de campos científicos e sua potencial relevância clínica impulsionaram um crescimento na pesquisa de EV e no interesse industrial1. A pesquisa de EV pequeno (sEV) concentra-se principalmente em exossomos, partículas de 40-100 nm que começam a formação nos endossomos iniciais antes da maturação e liberação através da fusão de corpos multivesiculares (MVB) para a membrana plasmática, bem como microvesículas, que brotam diretamente da membrana plasmática formando partículas de 80-1.000 nm2. Uma terceira população de EV são corpos apoptóticos, partículas de 50-1.500 nm formadas durante a morte celular, o que significa que sua proporção relativa a outros EVs pode ser muito variável3.

Como as características do VE podem representar mudanças que ocorrem em sua célula/tecido de origem, há potencial para seu uso em diagnósticos. Várias análises ‘ômicas’ começaram a identificar marcadores de origem celular e estado da doença, o que pode permitir a avaliação não invasiva de pacientes utilizando fontes de EV, como plasma/soro sanguíneo, urina, saliva e líquido cefalorraquidiano (LCR)4,5. Uma força motriz por trás dessas inovações relacionadas a EV são novas técnicas de caracterização que superam as limitações anteriores.

A necessidade e os desafios da caracterização de um único EV
A caracterização de EV único está se tornando cada vez mais importante tanto para validação quanto para a descrição de isolados de EV, bem como para elucidar as principais características dessas nanopartículas para a progressão de terapias e diagnósticos baseados em EV6. Dependendo da fonte de EV e do uso pretendido, a análise de pureza, muitas vezes descrita como uma proporção de partículas EV para não-EV ou como EV para proteína livre, pode exigir quantidades significativas de dados de múltiplas análises7.

A contagem de partículas e as medições de dimensionamento em publicações de EV já dependiam fortemente do rastreamento de nanopartículas (NTA), detecção de pulso resistivo (RPS) e microscopia eletrônica (EM)2. O NTA e o RPS padrão não têm a capacidade de distinguir EVs de partículas não-EV e têm suas próprias ressalvas, como taxa de transferência lenta8 e limite inferior inadequado de detecção observado com NTA 9,10,11.

As tetraspaninas CD9, CD63 e CD81 têm sido historicamente importantes identificadores para a presença de EVs em isolamentos/preparações de EV. Comumente, técnicas de western blotting (WB) e dot blotting são utilizadas para mostrar o enriquecimento dessas proteínas em isolados de EV em comparação com o lisado celular12. No entanto, a falta de quantificação para esses métodos e a heterogeneidade desses marcadores de EV, tanto no que se refere à exibição dentro das subpopulações de EV quanto à variação relacionada a células, tecidos ou pacientes, incentivam técnicas analíticas avançadas, que unificam a caracterização física e fenotípica13.

Citometria de nanofluxo como técnica abrangente de análise de EV
A determinação de concentrações verdadeiras de EV requer a identificação de partículas intactas e um marcador universal, particularmente em isolados de partículas complexas, com resolução capaz de detectar todos os EVs e distingui-los de partículas não-EV14.

A citometria de nanofluxo (nFCM) é uma técnica que permite a análise não marcada de partículas dimensionadas entre 45-1.000 nm, utilizando simultaneamente marcação fluorescente e detecção para identificar subpopulações de partículas. Uma das principais distinções da citometria de fluxo convencional é o uso de equipamentos dedicados à análise de nanopartículas, permitindo a maior resolução15. A análise de EV, que utiliza instrumentação de fluxo convencional reaproveitada para análise de pequenas partículas, está melhorando, mas ainda luta para alcançar a resolução para detectar e analisar EVs de <100 nm16,17. A citometria de fluxo baseada em contas é uma adaptação adicional frequentemente empregada para a análise de EV, mas isso elimina a possibilidade de detecção de partícula única e introduz vieses baseados em captura18.

Beneficiando-se de um limite inferior de detecção de ~45 nm no canal de dispersão lateral (SS) para análise de EV, o nFCM utiliza o acionamento SS. Isso pode ser pensado como análise de “partícula em primeiro lugar”, pois significa que os eventos devem fornecer um sinal SS, ultrapassando um limite definido antes da análise da intensidade de fluorescência. Isso remove falsos positivos, como agregações de membrana degradada e fluoróforo, e concentra a análise em EVs intactos15. As medições de SS também são usadas para dimensionar partículas individuais em comparação com um padrão de nanoesferas de sílica de quatro modais19. As medições de fluorescência são realizadas em dois detectores adicionais, permitindo três medições simultâneas para cada partícula para descrever a concentração de partículas, tamanhos e presença de marcadores ou outros alvos de interesse, a fim de identificar subpopulações de EV20.

No experimento a seguir, medidas de SS e fluorescentes (FL) são usadas para medir partículas de >45 nm, mostrar o subconjunto de EVs positivos para membrana e identificar a apresentação de CD9, CD63, CD81 em subpopulações de EV. Tanto a concentração dessas subpopulações quanto sua razão como parte do total de partículas medidas pela SS são descritas, assim como seus perfis de tamanho.

Protocol

1. Configuração do instrumento nFCM e medições dos padrões nFCM NOTA: Três medições são realizadas antes do início da aquisição de dados para amostras para validar o alinhamento correto do instrumento nFCM e fornecer uma forte comparação entre os instrumentos. Estes são o padrão de concentração / controle de qualidade (QC), padrão de tamanho e um espaço em branco. Diluir os talões QC 1:100 em água destilada num tubo adequado de 0,6 μL e colocar no compartimento de carga. No menu suspenso Fluxo de amostra, selecione Impulsionando para introduzir a amostra de QC no sistema por 45 s para substituir completamente a solução de amostra/limpeza anterior.Durante o impulso, defina a potência do laser para o modelo predefinido para contas QC “padrão FL QC de 250 nm”, por exemplo, 10/40 mW para o laser azul, 20/50 mW para o laser vermelho, com 0,2% de decaimento SS. Selecione a Pressão de amostragem no mesmo menu para baixo para reduzir a pressão do sistema. Ajuste a pressão de amostragem automática para 1,0 kPa para manter uma pressão constante. Inicie a análise de 1 minuto selecionando Tempo de Registro nos controles de aquisição. Os dados serão plotados no diagrama de pontos mostrando uma escala logarítmica para intensidade SS e uma intensidade FL selecionada. Insira o nome do arquivo e a diluição da amostra antes de salvá-lo. Selecione descarregar para remover o tubo do compartimento de carga. Substitua por 150 μL de solução de limpeza e limpe por >30 s selecionando Aumentar antes de remover a solução de limpeza selecionando Descarregar.Remova qualquer solução de limpeza em excesso da ponta capilar usando um tubo contendo 150 μL de água. Diluir as esferas padrão de tamanho 1:100 em água e carregar 100 μL no compartimento de carga, antes de aumentar a amostra por 45 s. Defina a potência do laser para o modelo predefinido “S16 exo 68-155 nm”. Essa configuração é para o padrão de tamanho e amostras contendo EVs < 200 nm. Por exemplo, 15/40 mW para o laser azul, 20/50 mW para o laser vermelho, com 0,2% de decaimento SS. Selecione Amostragem e prossiga para o registro da amostra por 1 minuto como antes. Execute a terceira medição com uma amostra de água ou PBS para criar uma medição em branco do seu eluente, identificando falsos positivos para remoção pelo software. A introdução das medidas padrão é descrita na seção a seguir. 2. Determinando a concentração de partículas de uma amostra não rotulada e gerando um relatório em PDF Diluir a amostra de EV não marcada em PBS para uma faixa de concentração de partículas adequada para análise nFCM, 1 x 10 8- 5 x 108 partículas/mL. Carregar 10-100 μL da amostra diluída no cais de carga. Quando a concentração de partículas for desconhecida, comece com uma diluição de 1:100 da amostra de EV. A concentração da amostra pode ser rapidamente aproximada pelo tamanho do ponto laser na câmera CCD durante o aumento ou pela observação do Event Burst Trace durante a amostragem. Aumente a amostra carregada por 45 s antes de selecionar Amostragem e registre por 1 min, salvando conforme descrito anteriormente. Para começar a analisar esses dados, alterne da guia Aquisição para a guia Análise . Abra os arquivos nfa salvos. Para permitir uma medição precisa da amostra, use as duas medições padrão feitas antes da medição da amostra para definir valores para comparação da amostra, bem como o espaço em branco. Crie a curva padrão de tamanho, para conversão de SS para diâmetro, selecionando primeiro o arquivo padrão de tamanho e usando a ferramenta de limite definido (também conhecida como limite automático). O limiar, visível no traço de explosão do evento, identifica a intensidade mínima de sinal necessária para que um evento seja considerado significativo. Com o limite definido, verifique se os parâmetros do gráfico de pontos x e y são SS-H ou SS-A no eixo x e FITC-A no eixo y. Abra a ferramenta de geração de curva padrão e selecione S16 exo 68-155 nm como o modelo de dimensionamento. Clique em Localizar picos para identificar as intensidades de SS de pico como uma partícula de 68, 91, 113 ou 155 nm de diâmetro. Verifique se a curva SS para diâmetro foi gerada com um valor r próximo a 1 antes de fechar a janela. Defina o padrão de concentração selecionando o arquivo salvo e clicando em Contar DST. Insira a concentração de partículas do padrão. Tendo definido as informações padrão, selecione o arquivo de amostra EV e defina o limite. Selecione o arquivo em branco e clique em Definir em branco para identificar o número de falsos positivos para remoção da contagem de amostras. Isso deve ser feito com o mesmo limite que sua amostra. Retorne ao arquivo de exemplo EV. Abra a ferramenta de geração de PDF e selecione Dimensionamento e concentração. Introduzir as diluições da amostra. A concentração da amostra e a distribuição de tamanho das partículas são mostradas. 3. Rotulagem da amostra NOTA: Duas estratégias de coloração podem ser usadas simultaneamente para uma análise abrangente das partículas em suspensão. Os protocolos de rotulagem geralmente exigem otimização para novos anticorpos ou fontes de amostra. Diluir uma porção da amostra de EV até uma concentração de 1,25 x 1010 partículas/ml em PBS. Incubar 8 μL da amostra de EV diluída com 1 μL de anticorpo e 1 μL de corante para uma concentração de partículas de 1 x 10 10 partículas/mL (as partículas totais serão 1 x 108 suspensas em10 μL). A razão de incubação para o anticorpo é de 1:50 (1 μL de 1:5 de anticorpo) neste caso.Use mais de três concentrações diferentes de anticorpos ou corantes durante a otimização, para fornecer dados indicando que o protocolo permite a máxima ligação do epítopo sem saturação excessiva do rótulo escolhido, o que pode prejudicar a identificação de eventos de fluorescência de baixa intensidade. A concentração de incubação para o corante de membrana é de 40 nM (1 μL de 400 nM). Misturar a amostra de 10 μL por vórtice durante 5 s e incubar a RT durante 30 min no escuro.NOTA: Recomendações para controles estão incluídas na discussão. Após a incubação, tomar 1 μL da amostra marcada e diluir 1:50 em PBS num tubo de 0,6 ml. Carregue a amostra no compartimento de carga e aplique pressão de aumento por 45 s. Certifique-se de que as configurações do laser estejam corretas e que as lentes apropriadas estejam carregadas. Alterne para a pressão de amostragem e selecione Tempo de gravação. Após a aquisição de 1 minuto, nomeie o arquivo de dados e salve. Descarregue a amostra e substitua por uma solução de limpeza. Aumente isso por >30 s antes de carregar a próxima amostra rotulada. 4. Análise nFCM-geração PDF para análise de subpopulações Para a geração de PDF, aplique os mesmos padrões que os feitos anteriormente; somente a medida em branco será definida de forma diferente. Selecione o arquivo de exemplo e defina o limite. No gráfico de pontos, altere o eixo y para mostrar as medidas FL do canal verde ou vermelho. Selecione a ferramenta de bloqueio de quadrados e use o botão esquerdo do mouse para desenhar um quadrado ao redor da população FL+. Abra o arquivo de medição em branco e clique em Definir em branco antes de reverter para o arquivo de amostra. Abra a ferramenta de geração de PDF como antes e a distribuição de tamanho, concentração e porcentagem (em comparação com todos os eventos SS+) são identificados para a subpopulação FL+.Repita para cada subpopulação de interesse identificada como “Total, P1, P2 etc.”

Representative Results

Apresentação de tetraspanina em EVs derivados de SW620 e EVs derivados de C2C12A análise moderna da abundância de tetraspaninas-chave CD9, CD63 e CD81 em EVs de uma variedade de fontes tem destacado a extrema variabilidade de sua presença, tanto em análises a granel quanto ao analisar sua apresentação em subpopulações de EV21. Isso provavelmente está relacionado à disponibilidade de diferentes vias de biogênese, como as vias dependentes e independentes do ESCRT22. CD9 foi apresentado na maior porcentagem de EVs C2C12 em ~50%, com apresentação de CD63 em apenas ~30%, na Figura 1. Quando a marcação foi realizada com todos os três anti-tetraspaninas em uma incubação, ~70% das partículas apresentaram pelo menos um dos marcadores EV. As medições repetidas mostraram menor desvio padrão para a marcação CD9/63/81 dos EVs C2C12 em ~3,8%, enquanto isso foi ~8,1% para os EVs C2C12 rotulados com CD81. Os EVs derivados de SW620 apresentaram um perfil de tetraspanina diferente, com uma diferença muito maior entre o CD9 mais apresentado em ~40% e o CD63 menos apresentado em ~7%. Semelhante aos EVs C2C12, o CD9 estava presente na maioria da população positiva para tetraspanina, já que a marcação combinada CD9/63/81 identificou ~42% das partículas como tendo pelo menos um dos três marcadores. A maioria das partículas derivadas de C2C12, a população SS+ total, variou em tamanho de 45-120 nm, com uma mediana de ~ 65 nm de diâmetro. Os perfis de tamanho para cada uma das subpopulações de EV rotuladas com tetraspanina, mostradas na Figura 1, são semelhantes entre si, mostrando um tamanho mediano maior de ~75-85 nm e menos EVs de <65 nm em comparação com a população total de partículas. As partículas derivadas de SW620 variaram entre 45-160 nm com um tamanho médio de ~65 nm, mostrando uma distribuição distorcida. Os EVs marcados com tetraspanina mostram uma distribuição mais normal e maior diâmetro mediano entre 90-110 nm, com distribuições semelhantes entre subpopulações individuais positivas para tetraspanina. Embora as tetraspaninas mais e menos apresentadas sejam as mesmas para essas duas linhagens celulares, sua representação proporcional difere muito e há uma diferença interessante entre a potencial co-apresentação de tetraspaninas observável a partir da diferença na positividade CD9 e a positividade CD9/63/81. Combinando a marcação da membrana EV com a marcação de anticorposA membrana bicamada dos EVs fornece um alvo de marcação mais genérico, o que pode permitir a distinção de partículas não-EV de tamanho semelhante, como agregados proteicos e algumas formas de LDL com monocamadas lipídicas23. A especificidade desse tipo de marcação deve ser validada, pois alguns corantes de membrana comuns usados em pesquisas de EV também demonstraram se ligar a partículas não-EV24. A marcação da membrana mostrou repetidamente ~80% de positividade de EVs derivados de C2C12 e EVs SW620. A intensidade do SS (SS-H) apresenta boa correlação com a intensidade da FITC nos gráficos de pontos dos resultados de C2C12 e SW620 mostrados na Figura 2. Isso é esperado, pois a intensidade de SS é relativa ao tamanho da partícula e, portanto, à área de superfície da membrana. A maioria dos EVs marcados com anticorpos também foi positiva para a marcação por membrana, mostrando porcentagens duplamente positivas (FITC+ e APC+) muito semelhantes às porcentagens positivas de tetraspanina. Os gráficos de pontos FITC vs APC mostram uma ligeira correlação entre a marcação de membrana e tetraspanina com a marcação CD63, parecendo mostrar a correlação mais fraca com a marcação de membrana. Poucos eventos foram detectados que foram positivos para a marcação de anticorpos, mas negativos para a marcação da membrana. Reprodutibilidade, eficiência de rotulagem dupla e saídas de dados alternativasUma consideração importante na concepção de experimentos nFCM é a interatividade de fluoróforo ou rótulo. A Figura 3a mostra que a repetição da marcação de anticorpos com e sem marcação adicional da membrana leva a medidas de positividade % muito semelhantes. Em particular, a rotulagem SW620 mostra muito pouca variação entre os dois conjuntos de medição. Isso mostra uma interferência limitada entre a ligação do corante e do anticorpo e também destaca a boa reprodutibilidade ao repetir a marcação do EV. As medições de intensidade, tanto a dispersão lateral quanto a fluorescência, podem ser exportadas para se destacarem para cada partícula individual medida. A partir disso, podemos gerar medições de intensidade média de fluorescência (MFI) para fornecer aproximações comparativas da abundância de nosso alvo marcado. A IFM para as populações fluorescentes de EVs derivados de C2C12 sugere uma apresentação ligeiramente menor de CD63 e CD81 com medidas de MFI de ~550 e ~600, respectivamente, em comparação com as ~850 MFI observadas para EVs CD9+. As unidades de medida para MFI neste caso são FL-A e não são padronizadas em relação a uma calibração fluorescente. O uso de todos os três anticorpos não provoca uma fluorescência muito maior do que apenas a marcação CD9. Isso é muito diferente das medições de IFM SW620, que sugerem que o uso de um coquetel de todos os três anticorpos fornece um sinal de fluorescência maior para EVs marcados do que o uso de qualquer rótulo de anticorpos individual. Os histogramas de distribuição de tamanho produzidos pelo software NanoFCM também podem ser exportados para o Excel, permitindo que os conjuntos de dados triplicados sejam sobrepostos. Os perfis de distribuição de tamanho da Figura 3 são semelhantes aos da Figura 1 , mas incluem barras de erro. O tamanho mediano do VE das subpopulações positivas de tetraspanina em EVs derivados de C2C12 mostra uma mediana em torno de 70 nm, ligeiramente maior do que a média de 60 nm das populações totais de partículas. SW620 EVs positivos para marcadores de tetraspanina são maiores, mostrando picos em ~100 nm. Figura 1: Subpopulações de EV CD9, CD63, CD81 positivas identificadas pela marcação de anticorpos . (A) Gráfico de barras mostrando a porcentagem de EVs marcados em comparação com o total de partículas observadas por SS para EVs derivados de C2C12. (B) Gráfico de barras mostrando a porcentagem de EVs marcados em comparação com o total de partículas observadas por SS para EVs derivados de SW620. (C) Perfis de distribuição de tamanho representativos para EVs derivados de C2C12. Cada histograma é retirado dos PDFs gerados para a primeira medição de conjuntos de dados triplicados. (D) Perfis de distribuição de tamanho representativo para EVs derivados de SW620. Cada histograma é retirado dos PDFs gerados para a primeira medição de conjuntos de dados triplicados. As barras de erro representam o desvio padrão das medições triplicadas das mesmas amostras rotuladas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Marcação por membrana e marcação de anticorpos de CD9, CD63, CD81 apresentando subpopulações de EV . (A) Gráfico de barras mostrando Membrane+ %, tetraspanin+ % e double+ % para C2C12 EVs. (B) Gráfico de barras mostrando Membrane+ %, tetraspanin+ % e double+ % para SW620 EVs. (C) Gráfico de pontos SS representativo vs FITC mostrando gating para a população positiva para membrana. (D) Gráficos de pontos FITC representativos vs APC mostrando gating para população duplamente positiva de EVs de C2C12. (E) Gráficos de pontos representativos FITC vs APC mostrando gating para população duplamente positiva de EVs de SW620. As barras de erro representam o desvio padrão das medições triplicadas das mesmas amostras rotuladas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Avaliação da variação nas medições repetidas . (A) Gráficos de barras mostrando % de positividade na marcação de anticorpos com e sem marcação adicional da membrana. (B) Medidas médias de intensidade de fluorescência para subconjuntos de EV fechados. (C) Histogramas de distribuição de tamanho médio para conjuntos de dados triplicados para EVs C2C12. (D) Histogramas de distribuição de tamanho médio para conjuntos de dados triplicados para EVs SW620. As barras de erro representam o desvio padrão das medições triplicadas das mesmas amostras rotuladas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Detalhes da amostra e do reagente
Dois isolados de EV de linhagens celulares separadas foram selecionados para demonstração de marcação fluorescente e subsequente análise nFCM. Ambos os conjuntos de EV foram suspensos em PBS e armazenados a -80 °C por <3 meses, mas a maioria das outras condições foi diferente entre os isolados. A linhagem celular de mioblastos de camundongos C2C12 representa um precursor embrionário das células musculares esqueléticas e foi cultivada em cultura 2D, condicionando o meio de crescimento por mais de 72 h antes do isolamento do VE por ultracentrifugação. SW620 é uma linhagem celular de adenocarcinoma de cólon humano e foi cultivada em um biorreator rudimentar, enriquecendo meios ao longo de 7 semanas, com isolamento de EV conduzido por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e frações 7-9 eluídas de colunas CL-2B de sefarose combinadas em uma única amostra.

Enquanto os EVs isolados e concentrados do CCM são os tipos de amostra mais fáceis de trabalhar, o nFCM é aplicável à maioria dos isolados de EV, incluindo biofluidos como soro, plasma, urina e LCR. Essas análises de amostras se beneficiam da detecção nFCM SS de todas as partículas, permitindo a corroboração com NTA, TRPS e outras análises de partículas, enquanto descrevem as subpopulações de EV marcadas fluorescentemente em termos quantitativos, bem como uma proporção do total, para uma abordagem imparcial de análise de partículas multiparâmetros. A análise de amostras de baixo processamento também é possível, como urina não clarificada e CCM enriquecida com EV com a ressalva de exigir proteína de baixa contaminação.

O corante de membrana aqui utilizado destina-se a integrar-se à bicamada lipídica, com uma porção lipofílica para carga de membrana e um corante hidrofílico para permanecer na membrana plasmática25. Atualmente, não existe um corante de marcação de EV perfeito e vários critérios devem ser considerados na escolha, incluindo especificidade para EVs, adequação com fixação ou permeabilização e eficiência de marcação de EV26.

A marcação de anticorpos conjugados fluorescentes de epítopos expostos à superfície tem se mostrado um método eficaz para a identificação de subpopulações de EV27. Um aspecto fundamental da otimização do protocolo é atender, e não exceder, o ponto de saturação de marcação para se ligar a todos os epítopos disponíveis sem inibir a detecção de partículas de baixa fluorescência, permitindo que o tampão circundante seja preenchido com anticorpo fluorescente não ligado28. Além disso, a disponibilidade de locais de ligação expostos para marcação de anticorpos é potencialmente influenciada por vários fatores. Demonstrou-se que as condições de armazenamento dos EVs afetam os perfis de concentração e tamanho dos EVs29 , com observações também indicando efeitos na marcação de anticorpos30. A presença de proteínas corona de superfície, modificações de proteínas e impactos de técnicas de isolamento também podem ter efeitos sobre a marcação de anticorpos em alguns casos. Em última análise, à medida que a utilização da marcação fluorescente se torna mais prevalente para estudos de EV, o design experimental e a otimização para múltiplas técnicas analíticas se tornarão mais refinados.

Para aumentar a precisão dos resultados, vários controles podem ser incluídos, como (1) controle PBS + corante, para avaliar a formação de micelas ou agregados em alguns corantes, que podem aparecer como partículas SS + na análise nFCM, (2) PBS + controle de anticorpos, agregados podem ocorrer, embora muitas vezes não sejam grandes o suficiente para espalhar luz suficiente para a detecção de SS, (3) amostra EV + controle de anticorpos IgG, comum na citometria de fluxo e usado para identificar qualquer ligação não específica, (4) amostra de partículas não-EV + controle de anticorpos/corantes – particularmente importante quando se precisa identificar EVs em amostras de partículas complexas, controles como partículas purificadas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou amostras depletadas/abladas de EV podem atuar como um controle negativo para validar a marcação seletiva, (5) controles positivos são difíceis de projetar, mas a validação de um anticorpo nas células é uma inclusão útil.

Apresentação de tetraspaninas em veículos elétricos
A marcação de anticorpos e membranas deste experimento demonstra o alto nível de dados quantitativos que podem ser obtidos em um pequeno período de tempo pela análise nFCM. A medição simultânea dos principais atributos físicos do diâmetro/concentração de partículas com as medições fenotípicas da presença de membrana e/ou proteína leva a descrições de alto nível de subpopulações dentro do isolamento de partículas.

É importante ressaltar que níveis variados das três tetraspaninas relacionadas a EV “chave”, CD9, CD63, CD81, foram identificados nessas duas amostras de EV. O CD9 foi apresentado na maior proporção de EVs tanto para os EVs derivados de C2C12 quanto para SW620, sendo CD81 e CD63 a segunda e a menor quantidade de proteínas, respectivamente.

Apesar de algumas semelhanças observadas aqui nos perfis de tetraspanina de EVs de duas fontes celulares muito diferentes, os níveis de CD9, CD63 e CD81 podem ser muito diferentes entre a linhagem celular e os EVs derivados do paciente31.

A diferença na expressão de CD63 entre as duas amostras de EV é particularmente relevante para a discussão em curso dos principais identificadores de “EV-ness”. Embora a apresentação de CD63 em apenas ~8% dos EVs SW620 possa ser inesperada por alguns, o CD63 tem sido sugerido como um identificador pobre dos diferentes tipos de EVs isolados por tamanho ou densidade32, e EVs negativos de tetraspanina foram identificados, mesmo quando descritos como exossomos33.

Identificação de EVs dentro de isolamentos de partículas complexas
A heterogeneidade dos perfis de tetraspanina EV, tanto na linhagem celular quanto nos EVs derivados de pacientes, adverte contra a dependência da captura de EVs à base de tetraspanina e destaca a necessidade futura de novos métodos de identificação de EV31. A marcação de EV independente de proteínas específicas pode revelar-se altamente benéfica para a identificação de EVs a partir de partículas não-EV de tamanho semelhante se a especificidade do EV puder ser comprovadamente muito alta. Isto é particularmente verdadeiro para isolados de EV biofluidos, pois tem sido sugerido que a concentração de EVs no plasma sanguíneo humano está na faixa de 10 a 10 partículas/mL, enquanto as lipoproteínas são medidas em 1016 por mL14,34. Mesmo após o enriquecimento de EV, estudos comparando a positividade de partículas para marcadores de tetraspanina e / ou marcador de LDL ApoB sugerem ~ 50-100x maior abundância de LDL em amostras de plasma livre de plaquetas (PFP) em comparação com EV35.

A técnica de isolamento utilizada afeta grandemente a gama de partículas não-EV co-isoladas, como lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL), lipoproteínas de densidade intermediária (IDL) e LDL36. Há também descrições de co-isolados de lipoproteínas ligados a EVs que, embora potencialmente desempenhem um papel biológico importante, tornam a obtenção de amostras puras de EV um objetivo desafiador35.

Por conseguinte, poder-se-ia argumentar que se colocaria uma maior ênfase na descrição das partículas que compõem uma amostra, em vez de se conseguir o isolamento de uma selecção pura mas limitada de VE. Conseguir uma descrição abrangente das partículas medindo a abundância de tetraspanina em volume e contagens de partículas separadamente pode ser insuficiente para determinar com precisão as concentrações de VE, particularmente de fontes biofluidas36,37. Identificar subpopulações em uma abordagem baseada em camadas, mostrando partículas totais, EVs e EVs apresentando certas proteínas, como demonstrado neste experimento, pode fornecer uma solução robusta para a caracterização de nanopartículas. Este tem sido o caso de projetos envolvendo carregamento de EV com projetos para futuras aplicações terapêuticas20 e identificação de EVs CD63+ com carga luminal, como mitocôndrias38.

nFCM dentro do repertório de análise de EV
Uma força da análise nFCM EV é a maneira como os dados podem corroborar e construir sobre as análises de EV mais comuns e formar pontes entre conjuntos de dados físicos e fenotípicos. No entanto, isso é baseado em protocolos de rotulagem precisos que muitas vezes precisam ser otimizados para reagentes de rotulagem exclusivos, como corantes e anticorpos. Um critério-chave para uma análise precisa é ter partículas marcadas suspensas em um tampão não fluorescente, que depende da remoção do excesso de fluoróforo não ligado ou do refinamento de protocolos para não exceder a saturação do epítopo.

Estudos comparativos mostraram que o dimensionamento nFCM de EVs fornece dados alinhados com TRPS e crio-TEM, técnicas que são descritas como mais precisas que a NTA para análise de tamanho de EV10,39. No entanto, como acontece com qualquer método de base óptica, a influência das propriedades ópticas heterogêneas observadas para EVs e as diferenças entre as propriedades ópticas do material de referência e EVs devem ser reconhecidas ao interpretar os dados10.

O Western blotting tem sido um método-chave para indicar o enriquecimento de EV através da identificação de marcadores de EV40. Mas o desejo de demonstrar a presença de tais marcadores em partículas tem impulsionado avanços nas análises citométricas de fluxo baseadas em EV17. No entanto, as resoluções necessárias para fornecer dados robustos são atualmente melhor alcançadas por meio de instrumentação dedicada no que diz respeito à luz dispersa e fluorescente19.

O nFCM fornece uma abordagem imparcial de descrever inicialmente todas as partículas irrelevantes de marcadores específicos, usando a medição de dispersão lateral, permitindo a corroboração com as técnicas mais comuns de NTA, RPS e TEM1, ao mesmo tempo em que adiciona medição fenotípica semelhante à WB ou Elisa de maneira quantitativa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer aos grupos de Owen Davies e Nick Peake por continuarem a fornecer material e experiência.

Materials

APC Anti-CD81 antibody (M38) abcam ab233259 Anti-Human CD81 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) Abcam ab82392 Anti-mouse CD9 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted abcam ab82389 Anti-Human CD9 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse CD63 antibody biolegend 143905 Anti-Mouse CD63 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse/rat CD81 antibody biolegend 104909 Anti-Mouse CD81 APC
conjugated antibody
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC invitrogen Via Fisherscientific A15712 Anti-Human CD63 APC
conjugated antibody
Celline AD1000 bioreactor Merck Z688037-5EA
Cleaning solution NanoFCM 17159 In house cleaning solution for nanoanalyser
EVs from C2C12 Gifted Mouse line
EVs from SW620 Gifted Human line
Memglow – Fluorogenic Membrane Probe Cytoskeleton MG01 non toxic cell membrane dye
NanoAnalyzer NanoFCM nano-flow cytometer for measurement of single particles
PBS, pH 7.2 Gibco Via Fisherscientific 12549079 Salt solution for dilution of samples and antibodies
Snaplock Microtubes, 0.60mL Axygen Via Fisherscientific 11371944 Tubes required to load sample into nanoanalyser
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Single Extracellular VesicleTransmembrane ProteinNano-flow CytometryEV CharacterizationParticle AnalysisLabel-free DetectionFluorescence DetectionVesicle SubpopulationsPlasmaCSFCell CultureVirusesLipid NanoparticlesNanomaterialsLabeling ProtocolQC BeadsPressure ControlSample DilutionCleaning SolutionSize Standard Beads

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Lees, R., Tempest, R., Law, A., Aubert, D., Davies, O. G., Williams, S., Peake, N., Peacock, B. Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (185), e64020, doi:10.3791/64020 (2022).
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