אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

פרטי דגימה ומגיב
שני מבודדי EV מקווי תאים נפרדים נבחרו להדגמה של תיוג פלואורסצנטי וניתוח nFCM לאחר מכן. שתי ערכות EV הושעו ב-PBS ואוחסנו בטמפרטורה של -80°C למשך <3 חודשים, אך רוב התנאים האחרים היו שונים בין מבודדים. קו תאי המיובלסט של עכבר C2C12 מייצג מבשר עוברי לתאי שריר השלד וגודלו בתרבית דו-ממדית, תוך התניית מדיום הגידול במשך 72 שעות לפני בידוד EV על ידי אולטרה-צנטריפוגציה. SW620 הוא קו תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי וגודל בביוריאקטור בסיסי, המעשיר את המדיה במשך 7 שבועות, עם בידוד EV שנערך על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ושברים 7-9 שהושלכו מעמודות SEPHAROSE CL-2B המשולבות לדגימה אחת.

בעוד שרכבים חשמליים מבודדים ומרוכזים מ-CCM הם סוגי הדגימות שהכי קל לעבוד איתם, nFCM ישים לרוב המבודדים של EV, כולל ביופלואידים כגון סרום, פלזמה, שתן ו-CSF. ניתוחי דגימות אלה נהנים מזיהוי nFCM SS של כל החלקיקים, ומאפשרים אימות עם NTA, TRPS וניתוחי חלקיקים אחרים, תוך תיאור תת-אוכלוסיות EV המסומנות באופן פלואורסצנטי במונחים כמותיים, כמו גם חלק מהסך הכל, לגישה בלתי משוחדת של ניתוח חלקיקים מרובי פרמטרים. ניתוח של דגימות מעובדות נמוכות אפשרי גם כן, כגון שתן לא מסוכם ו- CCM מועשר ב- EV עם אזהרה של צורך בחלבון מזוהם נמוך.

צבע הממברנה המשמש כאן נועד להשתלב בדו-שכבת השומנים, עם מואטי ליפופילי להעמסת ממברנה וצבע הידרופילי להשארת קרום הפלזמה²⁵. אין כיום צבע מושלם לתיוג EV ויש לקחת בחשבון מספר קריטריונים בעת הבחירה, כולל ספציפיות לרכבים חשמליים, התאמה עם קיבוע או חדירה, ויעילות של תיוג EV²⁶.

תיוג נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים של אפיטופים שנחשפו לפני השטח הוכח כשיטה יעילה לזיהוי תת-אוכלוסיות של EV²⁷. היבט מרכזי של אופטימיזציה של פרוטוקול הוא עמידה בנקודת הרוויה של התווית, ולא מעבר לכך, כדי להיקשר לכל האפיטופים הזמינים מבלי לעכב זיהוי של חלקיקים פלואורסצנטיים נמוכים על ידי מתן אפשרות למלא את המאגר שמסביב בנוגדן פלואורסצנטי לא מאוגד²⁸. בנוסף, הזמינות של אתרי קשירה חשופים לסימון נוגדנים עשויה להיות מושפעת מכמה גורמים. תנאי אחסון של כלי רכב חשמליים הוכחו כמשפיעים על פרופילי הריכוז והגודל של כלי רכב חשמליים²⁹ , כאשר תצפיות מצביעות גם על השפעות על תיוג נוגדנים³⁰. נוכחותם של חלבוני קורונה על פני השטח, שינויים בחלבונים והשפעות של טכניקות בידוד עשויים גם הם להשפיע על תיוג הנוגדנים במקרים מסוימים. בסופו של דבר, ככל שהשימוש בתוויות פלואורסצנטיות הופך נפוץ יותר במחקרי EV, תכנון ניסויי ואופטימיזציה של טכניקות אנליטיות מרובות יהפכו למעודנים יותר.

כדי להגדיל את הדיוק של התוצאות, ניתן לכלול מספר בקרות כגון (1) PBS + בקרת צבע, כדי להעריך את היווצרות מיצלה או צבירה בצבעים מסוימים, אשר יכולים להופיע כחלקיקי SS+ בניתוח nFCM, (2) PBS + בקרת נוגדנים, אגרגטים יכולים להתרחש, אם כי לעתים קרובות לא גדולים מספיק כדי לפזר מספיק אור לזיהוי SS, (3) דגימת EV + בקרת נוגדנים IgG, נפוץ בציטומטריה של זרימה ומשמש לזיהוי כל קשירה לא ספציפית, (4) דגימת חלקיקים שאינם EV + בקרת נוגדנים / צבע – חשוב במיוחד כאשר יש צורך לזהות כלי רכב חשמליים בדגימות חלקיקים מורכבות, בקרות כגון חלקיקי ליפופרוטאין מטוהרים בצפיפות נמוכה (LDL) או דגימות מדוללות/אבלציה של EV יכולות לשמש כבקרה שלילית לאימות תיוג סלקטיבי, (5) בקרות חיוביות קשות לתכנון אך אימות נוגדן על תאים הוא הכללה שימושית.

הצגת טטרספנינים על כלי רכב חשמליים
תיוג הנוגדנים והממברנות של ניסוי זה מדגים את הרמה הגבוהה של נתונים כמותיים שניתן להשיג במסגרת זמן קטנה על ידי ניתוח nFCM. מדידה סימולטנית של התכונות הפיזיקליות העיקריות של קוטר/ריכוז חלקיקים עם המדידות הפנוטיפיות של נוכחות הממברנה ו/או החלבון מובילה לתיאורים ברמה גבוהה של תת-אוכלוסיות בתוך בידוד חלקיקים.

חשוב לציין כי בשתי דגימות EV אלה זוהו רמות משתנות של שלושת הטטרספנינים הקשורים ל-EV, CD9, CD63, CD81. CD9 הוצג על החלק הגדול ביותר של כלי רכב חשמליים הן עבור כלי רכב חשמליים הנגזרים מ-C2C12 והן עבור SW620, כאשר CD81 ו-CD63 הם החלבונים השניים והפחות מוצגים, בהתאמה.

למרות כמה קווי דמיון שנצפו כאן בפרופילי הטטרספאנין של כלי רכב חשמליים משני מקורות תאים שונים מאוד, רמות של CD9, CD63 ו- CD81 יכולות להיות שונות מאוד בין קו התא לבין EVs³¹ שמקורם בחולה.

ההבדל בביטוי CD63 בין שתי דגימות EV רלוונטי במיוחד לדיון המתמשך במזהי מפתח של ‘EV-ness’. בעוד שהצגת CD63 רק ב~8% מכלי הרכב החשמליים SW620 עשויה להיות בלתי צפויה על ידי חלקם, CD63 הוצע כמזהה גרוע של הסוגים השונים של כלי רכב חשמליים המבודדים לפי גודל או צפיפות³², ורכבים חשמליים שליליים של טטרספנין זוהו, גם כאשר הם מתוארים כאקסוזומים^{דמויי 33}.

זיהוי כלי רכב חשמליים בתוך בידודים מורכבים של חלקיקים
ההטרוגניות של פרופילי טטרספנין EV, הן בקו התאים והן ברכבים חשמליים שמקורם בחולה, מזהירה מפני הסתמכות על לכידה מבוססת טטרספנין של כלי רכב חשמליים ומדגישה את הצורך העתידי בשיטות זיהוי EV חדשות³¹. תיוג EV ללא תלות בחלבונים ספציפיים עשוי להתגלות כמועיל מאוד לזיהוי כלי רכב חשמליים מחלקיקים בגודל דומה שאינם EV, אם ניתן להוכיח שספציפיות EV גבוהה מאוד. זה נכון במיוחד עבור מבודדי EV biofluid כפי שהוצע כי ריכוז של כלי רכב חשמליים בדם אנושי פלזמה הוא בטווח של 10 10 חלקיקים / מ”ל בעוד ליפופרוטאינים נמדדים ב^{10 16} לכל מ”ל^14,34. אפילו לאחר העשרת EV, מחקרים המשווים חיוביות חלקיקים עבור סמני טטרספנין ו/או סמן LDL ApoB מציעים שפע גדול פי ~50-100 של LDL בדגימות פלזמה נטולת טסיות (PFP) בהשוואה ל- EV³⁵.

טכניקת הבידוד המשמשת משפיעה מאוד על טווח החלקיקים שאינם EV מבודדים, כגון ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות בינונית (IDL) ו-LDL³⁶. ישנם גם תיאורים של קו-איזולטים של ליפופרוטאינים הקשורים לרכבים חשמליים, שאמנם ממלאים תפקיד ביולוגי חשוב, אך הופכים את השגת דגימות EV טהורות למטרה מאתגרת³⁵.

לכן, ניתן לטעון כי יש להתמקד יותר בתיאור החלקיקים המרכיבים דגימה, במקום להשיג בידוד של מבחר טהור אך מוגבל של כלי רכב חשמליים. השגת תיאור מקיף של חלקיקים על ידי מדידת שפע הטטרספאנין בכמויות גדולות וספירת חלקיקים בנפרד יכולה להיות לא מספיקה כדי לקבוע במדויק את ריכוזי הרכב החשמלי, במיוחד ממקורות ביופלואידיים^36,37. זיהוי תת-אוכלוסיות בגישה מבוססת שכבות, תוך הצגת סך כל החלקיקים, כלי הרכב החשמליים והרכבים החשמליים המציגים חלבונים מסוימים, כפי שהוכח בניסוי זה, עשוי לספק פתרון חזק לאפיון ננו-חלקיקים. זה היה המקרה עבור פרויקטים הכוללים טעינת EV עם עיצובים ליישומים טיפוליים עתידיים²⁰ וזיהוי של CD63+ EVs עם מטען לומינלי כגון מיטוכונדריה³⁸.

nFCM בתוך הרפרטואר של ניתוח EV
חוזק של ניתוח nFCM EV הוא הדרך שבה נתונים יכולים לאשש ולהתבסס על הניתוחים הנפוצים ביותר של EV וליצור גשרים בין מערכי נתונים פיזיים ופנוטיפיים. עם זאת, זה מבוסס על פרוטוקולי תיוג מדויקים שלעתים קרובות צריכים להיות מותאמים לריאגנטים ייחודיים לתיוג כגון צבעים ונוגדנים. קריטריון מרכזי לניתוח מדויק הוא תיוג חלקיקים המרחפים במאגר שאינו פלואורסצנטי, המסתמך על הסרת עודפי פלואורופור לא מאוגדים או על עידון הפרוטוקולים כך שלא יעלו על רוויית אפיטופים.

מחקרי השוואה הראו כי גודל nFCM של כלי רכב חשמליים מספק נתונים בהתאם ל-TRPS ול-cryo-TEM, טכניקות המתוארות כמדויקות יותר מ-NTA עבור ניתוח גודל EV ^10,39. עם זאת, כמו בכל שיטה מבוססת אופטיקה, יש להכיר בהשפעת התכונות האופטיות ההטרוגניות הנראות עבור כלי רכב חשמליים ובהבדלים בין התכונות האופטיות של חומר ייחוס לבין כלי רכב חשמליים בעת פירוש נתונים¹⁰.

כתם מערבי היה שיטה מרכזית לציון העשרת EV באמצעות זיהוי סמני EV⁴⁰. אבל הרצון להדגים את נוכחותם של סמנים כאלה על חלקיקים הניע התקדמות בניתוחים ציטומטריים של זרימה מבוססת EV¹⁷. עם זאת, ההחלטות הדרושות כדי לספק נתונים חזקים מושגות כיום בצורה הטובה ביותר באמצעות מכשור ייעודי בכל הנוגע לאור מפוזר ופלואורסצנטי¹⁹.

nFCM מספק גישה בלתי משוחדת של תיאור ראשוני של כל החלקיקים שאינם רלוונטיים לסמנים ספציפיים, על ידי שימוש במדידת פיזור צד, המאפשרת אימות עם הטכניקות הנפוצות ביותר של NTA, RPS ו- TEM¹, תוך הוספת מדידה פנוטיפית הדומה ל- WB או Elisa באופן כמותי.