FACS-isolamento e Cultura de Progenitores Fibro-Adipogênicos e Células-Tronco Musculares de Músculo Esquelético não perturbado e lesionado
Summary
A identificação precisa de células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) e células-tronco musculares (MuSCs) é fundamental para estudar sua função biológica em condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo fornece diretrizes para o isolamento, purificação e cultura de FAPs e MuSCs de músculos de camundongos adultos.
Abstract
As células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) são uma população de células mesenquimais mesenquimais (MSCs) residentes em músculos esqueléticos, capazes de diferenciar-se ao longo da linhagem fibrogênica, adipogênica, osteogênica ou condrogênica. Juntamente com células-tronco musculares (MuSCs), as FAPs desempenham um papel crítico na homeostase muscular, reparo e regeneração, mantendo e remodelando ativamente a matriz extracelular (ECM). Em condições patológicas, como danos crônicos e distrofias musculares, as FAPs passam por ativação aberrante e diferenciam-se em fibroblastos e adipócitos produtores de colágeno, levando à fibrose e infiltração gordurosa intramuscular. Assim, as FAPs desempenham um papel duplo na regeneração muscular, seja por meio da manutenção da rotatividade do MuSC e da promoção da reparação de tecidos ou contribuindo para a formação de cicatrizes fibrosas e infiltrações de gordura ectópica, que comprometem a integridade e a função do tecido muscular esquelético. Uma purificação adequada de FAPs e MuSCs é um pré-requisito para entender o papel biológico dessas células em condições fisiológicas e em condições patológicas. Aqui, descrevemos um método padronizado para o isolamento simultâneo de FAPs e MuSCs de músculos de membros de camundongos adultos usando a triagem celular ativada por fluorescência (FACS). O protocolo descreve em detalhes a dissociação mecânica e enzimática de células mononucleadas de músculos inteiros dos membros e músculos tibialis anteriores (TA) lesionados. FAPs e MuSCs são posteriormente isolados usando um classificador de células semi-automatizado para obter populações de células puras. Além disso, descrevemos um método otimizado para a cultura quiescente e ativada de FAPs e MuSCs, sozinhos ou em condições de cocultura.
Introduction
O músculo esquelético é o maior tecido do corpo, respondendo por ~40% do peso humano adulto, e é responsável por manter a postura, gerar movimento, regular o metabolismo de energia basal e a temperatura corporal1. O músculo esquelético é um tecido altamente dinâmico e possui uma notável capacidade de adaptação a uma variedade de estímulos, como estresse mecânico, alterações metabólicas e fatores ambientais diários. Além disso, o músculo esquelético se regenera em resposta a lesões agudas, levando à restauração completa de sua morfologia e funções2. A plasticidade muscular esquelética depende principalmente de uma população de células-tronco musculares residentes (MuSCs), também denominadas células satélites, que estão localizadas entre a membrana plasmática de miofibra e a lamina basal 2,3. Em condições normais, os MuSCs residem no nicho muscular em um estado quiescente, com apenas algumas divisões para compensar a rotatividade celular e repor a piscina de células-tronco4. Em resposta à lesão, os MuSCs entram no ciclo celular, proliferam e contribuem para a formação de novas fibras musculares ou retornam ao nicho em um processo de auto-renovação 2,3. Além dos MuSCs, a manutenção homeostática e a regeneração do músculo esquelético contam com o apoio de uma população de células residentes musculares chamadas progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs)5,6,7. As FAPs são células estromamicanas mesenquimais incorporadas no tecido conjuntivo muscular e capazes de diferenciar-se ao longo da linhagem fibrogênica, adipogênica, osteogênica ou condrogênica 5,8,9,10. Os FAPs fornecem suporte estrutural para muSCs, pois são uma fonte de proteínas de matriz extracelular no nicho de células-tronco musculares. As FAPs também promovem a manutenção a longo prazo do músculo esquelético, secretando citocinas e fatores de crescimento que fornecem suporte trófico para a miogênese e crescimento muscular 6,11. Após lesão muscular aguda, as FAPs proliferam rapidamente para produzir um nicho transitório que suporte a integridade estrutural do músculo regenerador e forneça um ambiente favorável para sustentar a proliferação e diferenciação dos MuSCs de forma paracrina5. À medida que a regeneração prossegue, as FAPs são liberadas do músculo regenerativo por apoptose, e seus números gradualmente retornam ao nível basal12. No entanto, em condições que favorecem lesões musculares crônicas, as FAPs substituem a sinalização pró-apoptótica e se acumulam no nicho muscular, onde se diferenciam em fibroblastos e adipócitos produtores de colágeno, levando a infiltrações de gordura ectópica e formação de cicatrizes fibrosas12,13.
Devido à sua multipotência e suas habilidades regenerativas, FAPs e MuSCs foram identificados como alvos prospectivos na medicina regenerativa para o tratamento de distúrbios musculares esqueléticos. Portanto, para investigar sua função e potencial terapêutico, é importante estabelecer protocolos eficientes e reprodutíveis para o isolamento e cultura de FAPs e MuSCs.
A triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) pode identificar diferentes populações celulares com base em características morfológicas, como tamanho e granularidade, e permite o isolamento específico das células com base no uso de anticorpos direcionados contra marcadores de superfície celular. Em camundongos adultos, os MuSCs expressam a molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1, também conhecido como CD106)14,15 e α7-Integrin15, enquanto os FAPs expressam o receptor do fator de crescimento derivado da plaqueta α (PDGFRα) e o antígeno de células-tronco 1 (Sca1 ou Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . No protocolo aqui descrito, os MuSCs foram identificados como CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, enquanto os FAPs foram identificados como CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativamente, os camundongos PDGFRαEGFP foram empregados para isolar os FPs como CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- eventos18,19. Além disso, comparamos a sobreposição entre o sinal fluorescente das células PDGFRα-GFP+ às células identificadas pelo marcador de superfície Sca1. Nossa análise mostrou que todas as células que expressam GFP também foram positivas para o Sca1, indicando que qualquer abordagem pode ser empregada para identificação e isolamento de FAPs. Finalmente, a coloração com anticorpos marcadores específicos confirmou a pureza de cada população celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estabelecer protocolos eficientes e reprodutíveis para a identificação e isolamento de populações de células-tronco adultas puras é o primeiro e mais crítico passo para entender sua função. FaPs isolados e MuSCs podem ser usados para realizar análises multiômicas em experimentos de transplante como um tratamento potencial para doenças musculares ou podem ser geneticamente modificados para modelagem de doenças na terapia celular-tronco.
O protocolo descrito aqui fornece diretrize…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Tom Cheung (Universidade de Ciência & Tecnologia de Hong Kong) por conselhos sobre o isolamento do MuSC. Este trabalho foi financiado pelo NIAMS-IRP através das bolsas NIH AR041126 e AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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