בידוד ותרבית FACS של אבות פיברו-אדיפוגניים ותאי גזע של שרירים משרירי שלד עכברים לא מופרעות ופצועים
Summary
הזיהוי המדויק של תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ותאי גזע של שרירים (MuSCs) הוא קריטי לחקר תפקודם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מספק הנחיות לבידוד, לטיהור ולתרבות של FAPs ו-MuSCs משרירי עכברים בוגרים.
Abstract
תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם אוכלוסייה של תאים סטרומליים מזנכימליים (MSCs) המתגוררים בשרירי השלד, המסוגלים להתמיין לאורך שושלת פיברוגנית, אדיפוגנית, אוסטאוגנית או כונדרוגנית. יחד עם תאי גזע של שרירים (MuSCs), FAPs ממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס שרירים, בשיקום ובהתחדשות, תוך שמירה פעילה ועיצוב מחדש של המטריצה החוץ-תאית (ECM). במצבים פתולוגיים, כגון נזק כרוני ודיסטרופיות שרירים, FAPs עוברים הפעלה חריגה ומתמיינים לפיברובלסטים ואדיפוציטים המייצרים קולגן, מה שמוביל לפיברוזיס ולחדירת שומן תוך שרירית. לפיכך, FAPs ממלאים תפקיד כפול בהתחדשות שרירים, בין אם על ידי שמירה על תחלופת MuSC וקידום תיקון רקמות או תרומה ליצירת צלקות פיברוטיות וחדירת שומן חוץ רחמי, הפוגעים בשלמות ובתפקוד של רקמת שריר השלד. טיהור נכון של FAPs ו- MuSCs הוא תנאי מוקדם להבנת התפקיד הביולוגי של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים כמו גם בתנאים פתולוגיים. במאמר זה נתאר שיטה מתוקננת לבידוד סימולטני של FAPs ו-MuSCs משרירי גפיים של עכברים בוגרים באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה (FACS). הפרוטוקול מתאר בפירוט את הדיסוציאציה המכנית והאנזימטית של תאים חד-גרעיניים משרירי גפיים שלמות ומשרירי טיביאליס קדמיים (TA) פצועים. FAPs ו-MuSCs מבודדים לאחר מכן באמצעות סדרן תאים אוטומטי למחצה כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהורות. בנוסף, אנו מתארים שיטה אופטימלית לגידול FAPs ו-MuSCs שקטים ומופעלים, לבד או בתנאי קולקולטורה.
Introduction
שריר השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף, המהווה ~ 40% ממשקל האדם הבוגר, והוא אחראי על שמירה על יציבה, יצירת תנועה, ויסות חילוף החומרים של האנרגיה הבסיסית וטמפרטורת הגוף1. שרירי השלד הם רקמה דינמית מאוד ובעלת יכולת יוצאת דופן להסתגל למגוון גירויים, כגון לחץ מכני, שינויים מטבוליים וגורמים סביבתיים יומיומיים. בנוסף, שריר השלד מתחדש בתגובה לפגיעה חריפה, מה שמוביל לשיקום מלא של המורפולוגיה והתפקודים שלו2. פלסטיות שרירי השלד מסתמכת בעיקר על אוכלוסייה של תאי גזע שריריים תושבים (MuSCs), המכונים גם תאי לוויין, הממוקמים בין קרום הפלזמה של מיופייבר לבין הלמינההבסיסית 2,3. בתנאים רגילים, MuSCs שוכנים בנישת השרירים במצב שקט, עם חלוקות מעטות בלבד כדי לפצות על תחלופת התאים ולחדש את מאגר תאי הגזע4. בתגובה לפציעה, MuSCs נכנסים למחזור התא, מתרבים, ותורמים ליצירת סיבי שריר חדשים או חוזרים לנישה בתהליך התחדשות עצמית 2,3. בנוסף ל-MuSCs, תחזוקה הומאוסטטית והתחדשות של שרירי השלד מסתמכים על תמיכתה של אוכלוסייה של תאי שריר מקומיים הנקראים אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs)5,6,7. FAPs הם תאים סטרומליים מזנכימליים המוטבעים ברקמת החיבור לשריר ומסוגלים להתמיין לאורך שושלת פיברוגנית, אדיפוגנית, אוסטאוגנית או כונדרוגנית 5,8,9,10. FAPs מספקים תמיכה מבנית ל-MuSCs מכיוון שהם מקור לחלבוני מטריצה חוץ-תאית בנישת תאי הגזע של השריר. FAPs גם מקדמים תחזוקה ארוכת טווח של שרירי השלד על ידי הפרשת ציטוקינים וגורמי גדילה המספקים תמיכה טרופית למיוגנזה ולצמיחת שרירים 6,11. לאחר פגיעה חריפה בשריר, FAPs מתרבים במהירות כדי לייצר נישה חולפת התומכת בשלמות המבנית של השריר המתחדש ומספקת סביבה חיובית לקיום התפשטות והתמיינות של MuSCs באופן פרקריני5. עם התקדמות ההתחדשות, FAPs מנוקים מהשריר הרגנרטיבי על ידי אפופטוזיס, ומספרם חוזר בהדרגה לרמה בסיסית12. עם זאת, בתנאים המעדיפים פגיעה כרונית בשרירים, FAPs גוברים על איתות פרו-אפופטוטי ומצטברים בנישת השרירים, שם הם מתבדלים לפיברובלסטים ואדיפוציטים המייצרים קולגן, מה שמוביל לחדירת שומן חוץ רחמי וליצירת צלקת פיברוטית12,13.
בשל הרב-פוטנטיות שלהם ויכולות ההתחדשות שלהם, FAPs ו- MuSCs זוהו כמטרות פוטנציאליות ברפואה רגנרטיבית לטיפול בהפרעות בשרירי השלד. לכן, כדי לחקור את תפקודם ואת הפוטנציאל הטיפולי שלהם, חשוב ליצור פרוטוקולים יעילים וניתנים לשחזור עבור בידוד ותרבות של FAPs ו- MuSCs.
מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) יכול לזהות אוכלוסיות תאים שונות על סמך מאפיינים מורפולוגיים כגון גודל וגרעיניות, ומאפשר בידוד ספציפי לתא בהתבסס על שימוש בנוגדנים המכוונים נגד סמני פני השטח של התא. בעכברים בוגרים, MuSCs מבטאים את מולקולת הידבקות תאי כלי הדם 1 (VCAM-1, הידועה גם בשם CD106)14,15 ו-α7-Integrin15, בעוד ש-FAPs מבטאים את α הקולטן של גורם הגדילה שמקורו בטסיות (PDGFRα) ואת האנטיגן של תאי הגזע 1 (Sca1 או Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . בפרוטוקול המתואר כאן, MuSCs זוהו כ-CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, בעוד ש-FAPs זוהו כ-CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. לחלופין, נעשה שימוש בעכברי PDGFRαEGFP כדי לבודד FAPs כ-CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- אירועים18,19. יתר על כן, השווינו את החפיפה בין האות הפלואורסצנטי של תאי PDGFRα-GFP+ לתאים שזוהו על ידי סמן פני השטח Sca1. הניתוח שלנו הראה כי כל התאים המבטאים GFP היו חיוביים גם עבור Sca1, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בכל אחת מהגישות לזיהוי ובידוד של FAPs. לבסוף, צביעה עם נוגדנים סמנים ספציפיים אישרה את הטוהר של כל אוכלוסיית תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
קביעת פרוטוקולים יעילים וניתנים לשחזור לזיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע בוגרים טהורים היא הצעד הראשון והקריטי ביותר לקראת הבנת תפקידם. ניתן להשתמש ב-FAPs וב-MuSCs מבודדים כדי לבצע ניתוח מולטיומיקה בניסויי השתלה כטיפול פוטנציאלי במחלות שרירים או שניתן להנדס גנטית עבור מודלים של מחלות בטיפו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לטום צ’אונג (אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה) על עצות בנושא בידוד MuSC. עבודה זו מומנה על ידי NIAMS-IRP באמצעות מענקי NIH AR041126 ו- AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
