FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Der Skelettmuskel ist das größte Gewebe im Körper, macht ~ 40% des erwachsenen menschlichen Gewichts aus und ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Körperhaltung, die Erzeugung von Bewegung, die Regulierung des Grundenergiestoffwechsels und der Körpertemperatur¹. Die Skelettmuskulatur ist ein hochdynamisches Gewebe und besitzt eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich an eine Vielzahl von Reizen wie mechanische Belastungen, metabolische Veränderungen und tägliche Umweltfaktoren anzupassen. Darüber hinaus regeneriert sich die Skelettmuskulatur als Reaktion auf akute Verletzungen, was zu einer vollständigen Wiederherstellung ihrer Morphologie und Funktionen führt². Die Plastizität der Skelettmuskulatur beruht hauptsächlich auf einer Population residenter Muskelstammzellen (MuSCs), auch Satellitenzellen genannt, die sich zwischen der Myofaser-Plasmamembran und der Basallamina ^2,3 befinden. Unter normalen Bedingungen befinden sich MuSCs in der Muskelnische in einem Ruhezustand, mit nur wenigen Teilungen, um den Zellumsatz zu kompensieren und den Stammzellpool wieder aufzufüllen⁴. Als Reaktion auf Verletzungen treten MuSCs in den Zellzyklus ein, vermehren sich und tragen entweder zur Bildung neuer Muskelfasern bei oder kehren in einem Selbsterneuerungsprozess in die Nische zurück ^2,3. Zusätzlich zu MuSCs hängt die homöostatische Aufrechterhaltung und Regeneration der Skelettmuskulatur von der Unterstützung einer Population muskelresidenter Zellen ab, die als fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) bezeichnet ^werden5,6,7. FAPs sind mesenchymale Stromazellen, die in das Muskelbindegewebe eingebettet sind und in der Lage sind, sich entlang der fibrogenen, adipogenen, osteogenen oder chondrogenen Linie 5,8,9,10 zu differenzieren. FAPs bieten strukturelle Unterstützung für MuSCs, da sie eine Quelle für extrazelluläre Matrixproteine in der Muskelstammzellnische sind. FAPs fördern auch die langfristige Erhaltung der Skelettmuskulatur, indem sie Zytokine und Wachstumsfaktoren sezernieren, die trophische Unterstützung für Myogenese und Muskelwachstum bieten ^6,11. Bei akuten Muskelverletzungen vermehren sich FAPs schnell, um eine vorübergehende Nische zu erzeugen, die die strukturelle Integrität des regenerierenden Muskels unterstützt und eine günstige Umgebung bietet, um die Proliferation und Differenzierung von MuSCs auf parakrine Weise aufrechtzuerhalten⁵. Mit fortschreitender Regeneration werden FAPs durch Apoptose aus dem regenerativen Muskel entfernt und ihre Anzahl kehrt allmählich auf das Basalniveau¹² zurück. Unter Bedingungen, die chronische Muskelverletzungen begünstigen, überschreiben FAPs jedoch die pro-apoptotische Signalisierung und sammeln sich in der Muskelnische an, wo sie sich in kollagenproduzierende Fibroblasten und Adipozyten differenzieren, was zu ektopischen Fettinfiltraten und fibrotischer Narbenbildung führt^12,13.

Aufgrund ihrer Multipotenz und ihrer regenerativen Fähigkeiten wurden FAPs und MuSCs als potenzielle Ziele in der regenerativen Medizin zur Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen identifiziert. Um ihre Funktion und ihr therapeutisches Potenzial zu untersuchen, ist es daher wichtig, effiziente und reproduzierbare Protokolle für die Isolierung und Kultur von FAPs und MuSCs zu erstellen.

Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kann verschiedene Zellpopulationen anhand morphologischer Merkmale wie Größe und Granularität identifizieren und ermöglicht eine zellspezifische Isolierung basierend auf der Verwendung von Antikörpern, die gegen Zelloberflächenmarker gerichtet sind. Bei erwachsenen Mäusen exprimieren MuSCs das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1, auch bekannt als CD106)14,15 und α7-Integrin¹⁵, während FAPs den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptor α (PDGFRα) und das Stammzellantigen 1 (Sca1 oder Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 exprimieren. . In dem hier beschriebenen Protokoll wurden MuSCs als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ identifiziert, während FAPs als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- identifiziert wurden. Alternativ wurden PDGFRαEGFP-Mäuse verwendet, um FAPs als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- Ereignisse^18,19 zu isolieren. Darüber hinaus verglichen wir die Überlappung zwischen dem Fluoreszenzsignal von PDGFRα-GFP+-Zellen mit Zellen, die durch den Oberflächenmarker Sca1 identifiziert wurden. Unsere Analyse zeigte, dass alle GFP-exprimierenden Zellen auch positiv für Sca1 waren, was darauf hindeutet, dass beide Ansätze für die Identifizierung und Isolierung von FAPs verwendet werden können. Schließlich bestätigte die Färbung mit spezifischen Markerantikörpern die Reinheit jeder Zellpopulation.