FACS-isolement et culture de progéniteurs fibro-adipogènes et de cellules souches musculaires à partir de muscles squelettiques de souris non perturbés et blessés
Summary
L’identification précise des cellules progénitrices fibro-adipogènes (PAF) et des cellules souches musculaires (MuSC) est essentielle pour étudier leur fonction biologique dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole fournit des lignes directrices pour l’isolement, la purification et la culture des PAF et des MuSC à partir de muscles de souris adultes.
Abstract
Les cellules progénitrices fibro-adipogènes (FAP) sont une population de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) résidentes du muscle squelettique capables de se différencier selon une lignée fibrogénique, adipogénique, ostéogénique ou chondromogène. Avec les cellules souches musculaires (MuSC), les FAP jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie, la réparation et la régénération musculaires, tout en maintenant et en remodelant activement la matrice extracellulaire (ECM). Dans des conditions pathologiques, telles que les dommages chroniques et les dystrophies musculaires, les FAP subissent une activation aberrante et se différencient en fibroblastes et adipocytes producteurs de collagène, entraînant une fibrose et une infiltration graisseuse intramusculaire. Ainsi, les FAP jouent un double rôle dans la régénération musculaire, soit en maintenant le renouvellement du MuSC et en favorisant la réparation des tissus, soit en contribuant à la formation de cicatrices fibrotiques et d’infiltrats de graisse ectopique, qui compromettent l’intégrité et la fonction du tissu musculaire squelettique. Une purification adéquate des FAP et des MuSC est une condition préalable à la compréhension du rôle biologique de ces cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous décrivons une méthode standardisée pour l’isolement simultané des FAP et des MuSC des muscles des membres de souris adultes en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le protocole décrit en détail la dissociation mécanique et enzymatique des cellules mononucléées des muscles entiers des membres et des muscles tibiaux antérieurs (TA) blessés. Les FAP et les MuSC sont ensuite isolés à l’aide d’un trieur de cellules semi-automatisé pour obtenir des populations de cellules pures. Nous décrivons en outre une méthode optimisée pour la culture de FAP et de MuSC quiescents et activés, seuls ou dans des conditions de coculture.
Introduction
Le muscle squelettique est le plus grand tissu du corps, représentant ~ 40% du poids humain adulte, et est responsable du maintien de la posture, de la génération de mouvement, de la régulation du métabolisme énergétique de base et de la température corporelle1. Le muscle squelettique est un tissu très dynamique et possède une capacité remarquable à s’adapter à une variété de stimuli, tels que le stress mécanique, les altérations métaboliques et les facteurs environnementaux quotidiens. En outre, le muscle squelettique se régénère en réponse à une blessure aiguë, conduisant à une restauration complète de sa morphologie et de ses fonctions2. La plasticité des muscles squelettiques repose principalement sur une population de cellules souches musculaires résidentes (MuSC), également appelées cellules satellites, situées entre la membrane plasmique myofibreuse et la lame basale 2,3. Dans des conditions normales, les MuSCs résident dans la niche musculaire dans un état de repos, avec seulement quelques divisions pour compenser le renouvellement cellulaire et reconstituer le pool de cellules souches4. En réponse à une blessure, les MuSCs entrent dans le cycle cellulaire, prolifèrent et contribuent à la formation de nouvelles fibres musculaires ou retournent dans la niche dans un processus d’auto-renouvellement 2,3. En plus des MuSC, le maintien homéostatique et la régénération du muscle squelettique reposent sur le soutien d’une population de cellules résidentes musculaires appelées progéniteurs fibro-adipogènes (PAF)5,6,7. Les FAP sont des cellules stromales mésenchymateuses intégrées dans le tissu conjonctif musculaire et capables de se différencier le long de la lignée fibrogénique, adipogénique, ostéogène ou chondrogène 5,8,9,10. Les FAP fournissent un soutien structurel aux MuSC car ils sont une source de protéines de la matrice extracellulaire dans la niche des cellules souches musculaires. Les PAF favorisent également le maintien à long terme du muscle squelettique en sécrétant des cytokines et des facteurs de croissance qui fournissent un soutien trophique à la myogenèse et à la croissance musculaire 6,11. Lors d’une lésion musculaire aiguë, les FAP prolifèrent rapidement pour produire une niche transitoire qui soutient l’intégrité structurelle du muscle régénérant et fournit un environnement favorable pour soutenir la prolifération et la différenciation des MuSC de manière paracrine5. Au fur et à mesure que la régénération progresse, les FAP sont éliminés du muscle régénératif par apoptose, et leur nombre revient progressivement au niveau basal12. Cependant, dans des conditions favorisant les lésions musculaires chroniques, les FAP remplacent la signalisation pro-apoptotique et s’accumulent dans la niche musculaire, où ils se différencient en fibroblastes et adipocytes producteurs de collagène, entraînant des infiltrats de graisse ectopique et la formation de cicatrices fibrotiques12,13.
En raison de leur multipotence et de leurs capacités de régénération, les FAP et les MuSC ont été identifiés comme des cibles potentielles en médecine régénérative pour le traitement des troubles des muscles squelettiques. Par conséquent, pour étudier leur fonction et leur potentiel thérapeutique, il est important d’établir des protocoles efficaces et reproductibles pour l’isolement et la culture des FAP et des MuSC.
Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) permet d’identifier différentes populations cellulaires en fonction de caractéristiques morphologiques telles que la taille et la granularité, et permet une isolation spécifique à la cellule basée sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire. Chez les souris adultes, les MuSC expriment la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire 1 (VCAM-1, également connue sous le nom de CD106)14,15 et α7-Integrin 15, tandis que les FAP expriment le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes α (PDGFRα) et l’antigène des cellules souches 1 (Sca1 ou Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . Dans le protocole décrit ici, les MuSC ont été identifiés comme CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, tandis que les FAP ont été identifiés comme CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativement, des souris PDGFRαEGFP ont été utilisées pour isoler les FAP en tant qu’événements CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-18,19. De plus, nous avons comparé le chevauchement entre le signal fluorescent des cellules PDGFRα-GFP+ et les cellules identifiées par le marqueur de surface Sca1. Notre analyse a montré que toutes les cellules exprimant la GFP étaient également positives pour Sca1, ce qui indique que l’une ou l’autre approche peut être utilisée pour l’identification et l’isolement des FAP. Enfin, la coloration avec des anticorps marqueurs spécifiques a confirmé la pureté de chaque population cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’établissement de protocoles efficaces et reproductibles pour l’identification et l’isolement des populations de cellules souches adultes pures est la première et la plus importante étape pour comprendre leur fonction. Les FAP et les MuSC isolés peuvent être utilisés pour effectuer des analyses multiomiques dans des expériences de transplantation en tant que traitement potentiel des maladies musculaires ou peuvent être génétiquement modifiés pour la modélisation de la maladie dans la thérapie par cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Tom Cheung (Université des sciences et technologies de Hong Kong) pour ses conseils sur l’isolement du MusC. Ce travail a été financé par le NIAMS-IRP grâce aux subventions AR041126 et AR041164 des NIH.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
