FACS-isolatie en kweek van fibro-adipogene voorlopers en spierstamcellen van onverstoorbare en gewonde muizenskeletspieren
Summary
De precieze identificatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en spierstamcellen (MuSC’s) is van cruciaal belang voor het bestuderen van hun biologische functie in fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol biedt richtlijnen voor de isolatie, zuivering en cultuur van FAPs en MuSC’s van volwassen muisspieren.
Abstract
Fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) zijn een populatie van mesenchymale stromale cellen (MSC’s) die in staat zijn om te differentiëren langs fibrogene, adipogene, osteogene of chondrogene afstamming. Samen met spierstamcellen (MuSC’s) spelen FAPs een cruciale rol bij spierhomeostase, herstel en regeneratie, terwijl ze de extracellulaire matrix (ECM) actief onderhouden en remodelleren. Bij pathologische aandoeningen, zoals chronische schade en spierdystrofieën, ondergaan FAPs afwijkende activering en differentiëren ze in collageenproducerende fibroblasten en adipocyten, wat leidt tot fibrose en intramusculaire vetinfiltratie. Faps spelen dus een dubbele rol bij spierregeneratie, hetzij door musc-omzet te ondersteunen en weefselherstel te bevorderen, hetzij door bij te dragen aan fibrotische littekenvorming en ectopische vetinfiltraten, die de integriteit en functie van het skeletspierweefsel in gevaar brengen. Een goede zuivering van FAPs en MuSCs is een voorwaarde voor het begrijpen van de biologische rol van deze cellen in fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we een gestandaardiseerde methode voor de gelijktijdige isolatie van FAPs en MuSC’s van ledemaatspieren van volwassen muizen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Het protocol beschrijft in detail de mechanische en enzymatische dissociatie van mononucleaire cellen van hele ledematen spieren en gewonde tibialis anterieure (TA) spieren. FAPs en MuSC’s worden vervolgens geïsoleerd met behulp van een semi-geautomatiseerde celsorteerder om zuivere celpopulaties te verkrijgen. Daarnaast beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor het kweken van rustige en geactiveerde FAPs en MuSC’s, alleen of in cocultuuromstandigheden.
Introduction
De skeletspieren zijn het grootste weefsel in het lichaam, goed voor ~ 40% van het volwassen menselijk gewicht, en is verantwoordelijk voor het handhaven van de houding, het genereren van beweging, het reguleren van het basale energiemetabolisme en de lichaamstemperatuur1. Skeletspieren zijn een zeer dynamisch weefsel en bezitten een opmerkelijk vermogen om zich aan te passen aan een verscheidenheid aan stimuli, zoals mechanische stress, metabole veranderingen en dagelijkse omgevingsfactoren. Bovendien regenereert de skeletspieren als reactie op acuut letsel, wat leidt tot volledig herstel van de morfologie en functies2. Skeletspierplasticiteit is voornamelijk afhankelijk van een populatie van residente spierstamcellen (MuSC’s), ook wel satellietcellen genoemd, die zich bevinden tussen het myofiberplasmamembraan en de basale lamina 2,3. Onder normale omstandigheden bevinden MuSC’s zich in de spierniche in een rustige toestand, met slechts een paar divisies om de cellulaire omzet te compenseren en de stamcelpool aan te vullen4. Als reactie op letsel komen MuSC’s de celcyclus binnen, prolifereren ze en dragen ze bij aan de vorming van nieuwe spiervezels of keren ze terug naar de niche in een zelfvernieuwingsproces 2,3. Naast MuSC’s zijn homeostatisch onderhoud en regeneratie van de skeletspieren afhankelijk van de ondersteuning van een populatie van spierresidente cellen genaamd fibro-adipogene voorlopers (FAPs)5,6,7. FAPs zijn mesenchymale stromale cellen ingebed in het spierbindweefsel en in staat om onderscheid te maken langs fibrogene, adipogene, osteogene of chondrogene afstamming 5,8,9,10. FAPs bieden structurele ondersteuning voor MuSC’s omdat ze een bron zijn van extracellulaire matrixeiwitten in de spierstamcelniche. FAPs bevorderen ook het langetermijnonderhoud van de skeletspieren door cytokines en groeifactoren af te scheiden die trofische ondersteuning bieden voor myogenese en spiergroei 6,11. Bij acuut spierletsel vermenigvuldigen FAPs zich snel om een voorbijgaande niche te produceren die de structurele integriteit van de regenererende spier ondersteunt en een gunstige omgeving biedt om de proliferatie en differentiatie van MuSC’s op een paracriene manier te ondersteunen5. Naarmate de regeneratie vordert, worden FAPs door apoptose uit de regeneratieve spier verwijderd en keren hun aantallen geleidelijk terug naar basaal niveau12. In omstandigheden die chronische spierbeschadiging bevorderen, overschrijven FAPs echter pro-apoptotische signalering en hopen ze zich op in de spierniche, waar ze differentiëren in collageenproducerende fibroblasten en adipocyten, wat leidt tot ectopische vetinfiltraten en fibrotische littekenvorming12,13.
Vanwege hun multipotentie en hun regeneratieve vermogens zijn FAPs en MuSC’s geïdentificeerd als potentiële doelwitten in de regeneratieve geneeskunde voor de behandeling van skeletspieraandoeningen. Daarom is het belangrijk om, om hun functie en therapeutisch potentieel te onderzoeken, efficiënte en reproduceerbare protocollen op te stellen voor de isolatie en cultuur van FAPs en MuSC’s.
Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan verschillende celpopulaties identificeren op basis van morfologische kenmerken zoals grootte en granulariteit, en maakt celspecifieke isolatie mogelijk op basis van het gebruik van antilichamen gericht tegen celoppervlakmarkers. Bij volwassen muizen drukken MuSC’s het vasculaire celadhesiemolecuul 1 (VCAM-1, ook bekend als CD106)14,15 en α7-Integrin15 tot expressie, terwijl FAPs de van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor tot expressie brengen α (PDGFRα) en het stamcelantigeen 1 (Sca1 of Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . In het hier beschreven protocol werden MuSC’s geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, terwijl FAPs werden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Als alternatief werden PDGFRαEGFP-muizen gebruikt om FAPs te isoleren als CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events18,19. Bovendien vergeleken we de overlapping tussen het fluorescerende signaal van PDGFRα-GFP+ cellen met cellen geïdentificeerd door de oppervlaktemarker Sca1. Onze analyse toonde aan dat alle GFP-expresserende cellen ook positief waren voor Sca1, wat aangeeft dat beide benaderingen kunnen worden gebruikt voor de identificatie en isolatie van FAPs. Ten slotte bevestigde kleuring met specifieke markerantistoffen de zuiverheid van elke celpopulatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het opstellen van efficiënte en reproduceerbare protocollen voor de identificatie en isolatie van zuiver volwassen stamcelpopulaties is de eerste en meest kritieke stap naar het begrijpen van hun functie. Geïsoleerde FAPs en MuSCs kunnen worden gebruikt om multiomics-analyse uit te voeren in transplantatie-experimenten als een potentiële behandeling voor spierziekten of kunnen genetisch worden gemodificeerd voor ziektemodellering in stamceltherapie.
Het hier beschreven protocol biedt gesta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Tom Cheung (The Hong Kong University of Science &Technology) bedanken voor advies over MuSC-isolatie. Dit werk werd gefinancierd door het NIAMS-IRP via NIH-subsidies AR041126 en AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
