細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ

細胞内小胞(IV)の一種であるエンドソームは、エンドサイトーシスによって形成され、その後リソソームに成熟します。さまざまな細胞内シグナル経路がIVの形成に関与しています。さらに、異なる内因性および外因性刺激がIVを損傷する可能性があります(たとえば、病原体は感染中に境界膜から逃げ出し、細胞質¹に入る可能性があります)。これは通常、エンドサイトーシス小胞²の破裂を伴う。したがって、IVを標的にして損傷を与えるための技術は、^{関連する研究3}で使用できます。

光線力学療法(PDT)は、腫瘍や病原体を殺すことによって病気と戦うための光依存療法です⁴。PDTでは、標的細胞は、光増感剤と呼ばれる非毒性発色団で標識され、光照射によって局所的に活性化され得る^5,6。光増感剤は光からエネルギーを吸収して励起一重項状態に変化し、長寿命の励起三重項状態になります。三重項状態の光増感剤は、電子またはエネルギー移動を受け、酸素の存在下で活性酸素種(ROS)を形成することができ、照明領域⁷内の標識細胞を空間的に破壊することができる。結果は光の力によって異なります⁸.光増感剤の濃度と光照射の強度を制御することにより、発色団支援光不活性化(CALI)⁹と呼ばれる、細胞溶解なしで標的生体分子を選択的に不活性化することができます。さまざまな細胞内標的を選択的に標識できる光増感剤の大幅な開発により、CALIは、ヌクレオチドやタンパク質などの低分子生体分子、およびミトコンドリアやエンドリソソームなどの細胞小器官の生体分子の光を介した不活性化を制御するための貴重なツールになりました3,10,11,12,13。

CALIと比較して、細菌毒素^14,15やリソソーム損傷に対するLeu-Leu-OMe¹⁶治療などの膜を損なうために化学的または物理的方法も使用されます。ただし、これらの方法では、細胞内のIVの大量の障害が表示されます。堅牢な光増感剤(すなわち、Al(III)フタロシアニンクロリドジスルホン酸(AlPcS_2a))がCALIで使用されます。_AlPcS2aは、エンドサイトーシスを介してリソソームを標的とし、制御領域¹⁷においてエンドソームまたはリソソームを破裂させるために使用される。_AlPcS2aは、細胞膜不透過性のフタロシアニンベースの発色団であり、原形質膜上の脂質に結合し、エンドサイトーシスを介してインターナライズされ、最終的にはエンドサイトーシス経路¹⁸を介してリソソーム内に蓄積する。近赤外スペクトル領域内の光を吸収し、励起されたAlPcS_2a¹⁸によって生成される主要なROSである一重項酸素を生成します。一重項酸素の崩壊は、細胞内の小さな領域(約10-20 nm)内での拡散と反応の距離を急速に制限します¹⁹。AlPcS_2aインキュベーションと光照明の持続時間を調整することにより、細胞内領域内のIVの損傷の時空間制御が可能になります。したがって、CALIは、IV損傷の結果、およびIVの形成と調節を調べるための強力なツールになります。

この研究では、光増感剤としてAlPcS_2aを使用するCALIの特定のプロトコルに対処します。このプロトコルは、エンドソームやリソソームを含むさまざまなタイプのIVに適用でき、膜破裂後のフォローアップ応答を調べるために使用できます。リソソーム破裂後に明らかにされた蛍光色素結合ガレクチン-3^16,20を発現するHeLa細胞を使用して、このプロトコルを実証します。