Ein photodynamischer Ansatz zur Untersuchung der Funktion der intrazellulären Vesikelruptur
Summary
Die AlPcS2a-vermittelte Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der raumzeitlichen Schädigung intrazellulärer Vesikel (IVs) in lebenden Zellen.
Abstract
Intrazelluläre Vesikel (IVs) werden durch Endozytose von Vesikeln in das Zytoplasma gebildet. Die IV-Bildung ist an der Aktivierung verschiedener Signalwege durch Permeabilisierung von IV-Membranen und die Bildung von Endosomen und Lysosomen beteiligt. Eine Methode namens Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) wird angewendet, um die Bildung von Infusionen und die Materialien zur Steuerung der Infusionsregulation zu untersuchen. CALI ist eine bildgebende photodynamische Methode zur Untersuchung des durch Membranpermeabilisierung induzierten Signalwegs. Die Methode erlaubt es, die selektierte Organelle räumlich und zeitlich in einer Zelle zu permeabilisieren. Die CALI-Methode wurde angewendet, um bestimmte Moleküle durch die Permeabilisierung von Endosomen und Lysosomen zu beobachten und zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Membranriss von IVs selektiv glykanbindende Proteine wie Galektin-3 rekrutiert. Hier beschreibt das Protokoll die Induktion einer IV-Ruptur durch AlPcS2a und die Verwendung von Galektin-3 als Marker zur Markierung beeinträchtigter Lysosomen, was nützlich ist, um die nachgeschalteten Effekte der IV-Membranruptur und ihre nachgeschalteten Effekte unter verschiedenen Situationen zu untersuchen.
Introduction
Endosomen, eine Art intrazellulärer Vesikel (IV), werden durch Endozytose gebildet und reifen dann zu Lysosomen heran. Verschiedene intrazelluläre Signalwege sind an der Bildung von Infusionen beteiligt; Darüber hinaus können unterschiedliche intrinsische und extrinsische Reize IVs schädigen (z. B. können Krankheitserreger während der Infektion aus der gebundenen Membran entweichen und in das Zytoplasma1 gelangen). Dies geht in der Regel mit der Ruptur endozytotischer Vesikeleinher 2. Daher können die Techniken zur gezielten und schädigenden Infusion in verwandten Studienverwendet werden 3.
Die Photodynamische Therapie (PDT) ist eine lichtabhängige Therapie zur Bekämpfung von Krankheiten durch Abtötung von Tumoren oder Krankheitserregern4. Bei der PDT werden die Zielzellen mit nicht-toxischen Chromophoren, sogenannten Photosensibilisatoren, markiert, die durch Lichtbeleuchtung lokal aktiviert werden können 5,6. Photosensibilisatoren absorbieren Energie aus Licht und wandeln sich in einen angeregten Singulett-Zustand um, was zum langlebigen angeregten Triplett-Zustand führt. Photosensibilisatoren des Triplett-Zustands können Elektronen- oder Energietransfer durchlaufen und in Gegenwart von Sauerstoff reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bilden und markierte Zellen innerhalb des Beleuchtungsbereichs7 räumlich zerstören. Die Konsequenz variiert je nach Lichtstärke8. Durch die Kontrolle der Konzentration von Photosensibilisatoren und der Intensität der Lichtbeleuchtung können gezielte Biomoleküle selektiv inaktiviert werden, ohne dass eine Zelllyse erforderlich ist, was als chromophorgestützte Lichtinaktivierung (CALI) bezeichnet wird9. Mit der bedeutenden Entwicklung von Photosensibilisatoren, die verschiedene subzelluläre Ziele selektiv markieren können, ist CALI zu einem wertvollen Werkzeug geworden, um die lichtvermittelte Inaktivierung von Biomolekülen für kleine Biomoleküle wie Nukleotide und Proteine sowie von Organellen wie Mitochondrien und Endolysosomenzu kontrollieren 3,10,11,12,13.
Im Vergleich zu CALI werden auch chemische oder physikalische Methoden zur Schädigung von Membranen eingesetzt, wie z.B. bakterielles Toxin 14,15 und Leu-Leu-OMe16 Behandlung bei lysosomalen Schäden. Diese Methoden zeigen jedoch eine massive Beeinträchtigung der intravenösen Infusionen innerhalb der Zellen. Robuste Photosensibilisatoren (d. h. Al(III)-phthalocyaninchloriddisulfonsäure (AlPcS2a)) werden in CALI verwendet; AlPcS2a, das durch Endozytose auf die Lysosomen abzielt, wird verwendet, um Endosomen oder Lysosomen in einer kontrollierten Regionaufzubrechen 17. AlPcS2a ist ein Zellmembran-undurchlässiger Phthalocyanin-basierter Chromophor, der an Lipide auf der Plasmamembran bindet und durch Endozytose internalisiert wird und sich schließlich über den endozytären Weg im Lysosom anreichert18. Es absorbiert Licht in einem nahinfraroten Spektralbereich und erzeugt Singulett-Sauerstoff, eine wichtige ROS, die durch angeregtes AlPcS2a 18 erzeugt wird. Der schnelle Zerfall des Singulett-Sauerstoffs begrenzt seine Diffusion und Reaktionsdistanz innerhalb eines winzigen Bereichs in Zellen (ca. 10-20 nm)19. Durch die Anpassung der Dauer der AlPcS2a-Inkubation und der Lichtbeleuchtung wird eine raumzeitliche Kontrolle der Schädigung von IVs innerhalb eines subzellulären Bereichs ermöglicht. CALI wird daher zu einem mächtigen Werkzeug, um die Folgen von IV-Schäden sowie die Bildung und Regulation von IVs zu untersuchen.
In dieser Studie wird ein spezifisches CALI-Protokoll unter Verwendung von AlPcS2a als Photosensibilisator untersucht. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Arten von Infusionen, einschließlich Endosomen und Lysosomen, angewendet und verwendet werden, um die Folgereaktionen nach einem Membranriss zu untersuchen. HeLa-Zellen, die Fluorophor-konjugiertes Galectin-3 16,20 exprimieren, das nach Lysosomenruptur sichtbar ist, werden verwendet, um dieses Protokoll zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
AlPcS2a bindet an die Plasmamembran, wird dann durch Endozytose internalisiert und reichert sich schließlich in Lysosomen an. AlPcS2a kann somit durch Anpassung der Inkubationsdauer in den subzellulären Kompartimenten lokalisiert werden. Eine Einschränkung dieser Methodik besteht darin, dass nur eine Subpopulation von IVs durch Endozytose durch AlPcS2a markiert werden konnte, da es viele andere Membranquellen für IVs gibt, wie z.B. ER- und Golgi-Apparate. Darüber hinaus wäre die sel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS, für die Unterstützung bei der Forschung. Die Core Facility wird durch das Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213) finanziert. Die Autoren danken der Common Equipment Core Facility des Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) für die Unterstützung bei der Bildaufnahme.
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
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