Uma abordagem fotodinâmica no estudo da função da ruptura de vesículas intracelulares

Os endossomos, um tipo de vesícula intracelular (IV), são formados pela endocitose e depois amadurecem em lisossomos. Várias vias de sinal intracelular estão envolvidas na formação de IVs; além disso, diferentes estímulos intrínsecos e extrínsecos podem danificar IVs (por exemplo, patógenos podem escapar da membrana limitada durante a infecção e entrar no citoplasma¹). Geralmente é acompanhada de ruptura de vesículas endocitóticas². Portanto, as técnicas de direcionamento e lesão de IVs podem ser utilizadas em estudos^{relacionados3}.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma terapia fotodependente para combater doenças matando tumores ou patógenos⁴. Na TFD, as células-alvo são marcadas com cromóforos atóxicos, denominados fotossensibilizadores, que podem ser ativados localmente pela iluminação luminosa ^5,6. Os fotossensibilizadores absorvem a energia da luz e se transformam em um estado singlete excitado, levando ao estado trigêmeo excitado de longa duração. Os fotossensibilizadores do estado triplete podem sofrer transferência eletrônica ou de energia e formar espécies reativas de oxigênio (EROs) na presença de oxigênio, podendo destruir espacialmente células marcadas dentro da região de iluminação⁷. A consequência varia de acordo com a potência da luz⁸. Controlando a concentração de fotossensibilizadores e a intensidade da iluminação luminosa, biomoléculas alvo podem ser seletivamente inativadas sem lise celular, denominada inativação luminosa assistida por cromóforos (CALI)⁹. Com o significativo desenvolvimento de fotossensibilizadores que podem marcar seletivamente vários alvos subcelulares, o CALI tornou-se uma ferramenta valiosa para controlar a inativação mediada pela luz de biomoléculas para pequenas biomoléculas, como nucleotídeos e proteínas, bem como organelas, como mitocôndrias e endolisossomos3,10,11,12,13.

Comparado ao CALI, métodos químicos ou físicos também são utilizados para prejudicar as membranas, como a toxina bacteriana ^14,15 e o tratamento com Leu-Leu-OMe¹⁶ para danos lisossômicos. No entanto, esses métodos mostram comprometimento em massa de IVs dentro das células. Fotossensibilizadores robustos (i.e., ácido dissulfônico de cloreto de ftalocianina Al(III) (AlPcS_2a)) são usados em CALI; O AlPcS_2a, que tem como alvo os lisossomos através da endocitose, é usado para romper endossomos ou lisossomos em uma região controlada¹⁷. AlPcS_2a é um cromóforo à base de ftalocianina impermeável à membrana celular que se liga a lipídios na membrana plasmática e é internalizado através de endocitose e eventualmente se acumula dentro do lisossomo através da via endocítica¹⁸. Ele absorve luz dentro de uma região espectral no infravermelho próximo e gera oxigênio singlete, uma das principais ROS geradas pelo AlPcS_2a¹⁸ excitado. O decaimento do oxigênio singlete limita rapidamente sua difusão e distância de reação dentro de uma minúscula região das células (aproximadamente 10-20 nm)¹⁹. Ao ajustar a duração da incubação do AlPcS_2a e a iluminação da luz, é permitido o controle espaço-temporal do dano de IVs dentro de uma área subcelular. O CALI torna-se, portanto, uma ferramenta poderosa para examinar as consequências dos danos IV, e a formação e regulação dos IVs.

Neste estudo, um protocolo específico de CALI usando AlPcS_2a como fotossensibilizador é abordado. Este protocolo pode ser aplicado a vários tipos de IVs, incluindo endossomos e lisossomos, e usado para examinar as respostas de seguimento após a ruptura da membrana. Células HeLa expressando galectina-3 conjugada com fluoróforo^16,20 reveladas após ruptura do lisossomo são utilizadas para demonstrar este protocolo.