גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית
Summary
AlPcS2a-mediated chromophore-assisted laser inactivation (CALI) הוא כלי רב עוצמה לחקר נזק מרחבי-זמני של שלפוחיות תוך-תאיות (IVs) בתאים חיים.
Abstract
שלפוחיות תוך תאיות (IVs) נוצרות באמצעות אנדוציטוזה של שלפוחיות לתוך ציטופלסמה. היווצרות IV מעורבת בהפעלת מסלולי אות שונים באמצעות חדירה של ממברנות IV והיווצרות אנדוזומים וליזוזומים. שיטה בשם השבתת לייזר בסיוע כרומופור (CALI) מיושמת כדי לחקור את היווצרות העירויים ואת החומרים בבקרת ויסות IV. CALI היא מתודולוגיה פוטודינמית מבוססת הדמיה לחקר מסלול האיתות המושרה על ידי חדירת ממברנה. השיטה מאפשרת מניפולציה מרחבית-זמנית של האברון שנבחר להיות חדירה בתא. שיטת CALI יושמה כדי לצפות ולנטר מולקולות ספציפיות באמצעות חדירה של אנדוזומים וליזוזומים. הקרע בקרום העירוי ידוע כמגייס באופן סלקטיבי חלבונים קושרי גליקן, כגון גלקטין-3. כאן, הפרוטוקול מתאר את השראת הקרע IV על ידי AlPcS2a ואת השימוש בגלקטין-3 כסמן לסימון ליזוזומים לקויים, אשר שימושי בחקר ההשפעות במורד הזרם של קרע קרום IV ואת ההשפעות במורד הזרם במצבים שונים.
Introduction
אנדוזומים, סוג של שלפוחית תוך תאית (IV), נוצרים על ידי אנדוציטוזה ולאחר מכן מתבגרים לליזוזומים. מסלולי אות תוך תאיים שונים מעורבים בהיווצרות עירויים; בנוסף, גירויים פנימיים וחיצוניים שונים יכולים לפגוע בעירוי (למשל, פתוגנים יכולים לברוח מהקרום התחום במהלך ההדבקה ולהיכנס לציטופלסמה1). זה בדרך כלל מלווה קרע של שלפוחיות endocytotic2. לכן, ניתן להשתמש בטכניקות למיקוד ופגיעה בעירוי במחקרים קשורים3.
טיפול פוטודינמי (PDT) הוא טיפול תלוי אור להילחם במחלות על ידי הריגת גידולים או פתוגנים4. ב-PDT, תאים ממוקדים מסומנים בכרומופורים לא רעילים, הנקראים פוטונסיטייזרים, שיכולים להיות מופעלים מקומית על ידי תאורת אור 5,6. פוטו-סנסיטייזרים סופגים אנרגיה מהאור והופכים למצב סינגלט מעורר, מה שמוביל למצב השלישייה הנרגשת מאריכת החיים. פוטוסנסיטיזרים של מצב השלישייה יכולים לעבור העברת אלקטרונים או אנרגיה וליצור מיני חמצן תגובתי (ROS) בנוכחות חמצן, ויכולים להרוס מרחבית תאים מסומנים באזור ההארה7. התוצאה משתנה בהתאם לעוצמת האור8. על ידי שליטה בריכוז הפוטונסיטייזרים ובעוצמת תאורת האור, ביומולקולות ממוקדות יכולות להיות מושבתות באופן סלקטיבי ללא ליזה של תאים, המכונה השבתת אור בסיוע כרומופור (CALI)9. עם הפיתוח המשמעותי של פוטונסיטייזרים שיכולים לתייג באופן סלקטיבי מטרות תת-תאיות שונות, CALI הפך לכלי רב ערך לשליטה בנטרול בתיווך אור של ביומולקולות עבור ביומולקולות קטנות כגון נוקלאוטידים וחלבונים, כמו גם אברונים כגון מיטוכונדריה ואנדו-ליזוזומים 3,10,11,12,13.
בהשוואה ל- CALI, שיטות כימיות או פיזיקליות משמשות גם לפגיעה בקרום, כגון רעלן חיידקי 14,15 וטיפול Leu-Leu-OMe16 לנזק ליזוזומלי. עם זאת, שיטות אלה מציגות פגיעה בכמות גדולה של עירויים בתוך תאים. פוטונסיטייזרים חזקים (כלומר, Al(III) phthalocyanine chloride disulfonic acid (AlPcS2a)) משמשים ב- CALI; AlPcS2a, המכוון את הליזוזומים באמצעות אנדוציטוזה, משמש לקרע אנדוזומים או ליזוזומים באזור מבוקר17. AlPcS2a הוא כרומופור מבוסס פתלוציאנין אטום לקרום התא הנקשר לשומנים בקרום הפלזמה ומופנם באמצעות אנדוציטוזה ובסופו של דבר מצטבר בתוך הליזוזום דרך המסלול האנדוציטי18. הוא בולע אור בתוך אזור ספקטרלי קרוב לאינפרא אדום ומייצר חמצן סינגלט, ROS עיקרי שנוצר על ידי AlPcS2a18 מעורר. דעיכת חמצן סינגלט מגבילה במהירות את הדיפוזיה שלו ואת מרחק התגובה שלו בתוך אזור זעיר בתאים (בערך 10-20 ננומטר)19. על ידי התאמת משך הדגירה ותאורת האור של AlPcS2a, מותרת בקרה מרחבית-זמנית על נזקי העירויים באזור תת-תאי. קאל”י הופכת אפוא לכלי רב עוצמה לבחינת ההשלכות של נזק לעירוי, והיווצרותם וויסותם של עירויים.
במחקר זה, פרוטוקול ספציפי של CALI המשתמש ב- AlPcS2a כפוטוסנסיטיזר מטופל. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על סוגים שונים של עירויים, כולל אנדוזומים וליזוזומים, ומשמש לבחינת תגובות המעקב לאחר קרע בממברנה. תאי HeLa המבטאים גלקטין מצומד-3 פלואורופור16,20 המתגלים לאחר קרע ליזוזום משמשים להדגמת פרוטוקול זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
AlPcS2a נקשר לקרום הפלזמה, ואז מופנם על ידי אנדוציטוזה ובסופו של דבר מצטבר בליזוזומים. לפיכך ניתן למקם AlPcS2a בתאים התת-תאיים על ידי התאמת משך הדגירה. מגבלה של מתודולוגיה זו היא שרק תת-אוכלוסייה של עירויים יכולה להיות מסומנת על ידי AlPcS2a באמצעות אנדוציטוזה מכיוון שישנם מקורות ממ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ל-Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS על התמיכה במחקר. מתקן הליבה ממומן על ידי Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). המחברים מודים למתקן הליבה של ציוד משותף של המכון למדעים ביו-רפואיים (IBMS), אקדמיה סיניקה (AS) על הסיוע ברכישת התמונה.
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
- Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972 (2014).
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
- Kübler, A. C. Photodynamic therapy. Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).
- De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
- Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
- Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
- Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Hsieh, C. W., Yang, W. Y. Triggering mitophagy with photosensitizers. Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
- Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
- Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
- Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
- Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
- Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
- Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
- Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
- Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
- Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
- Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. Assays to monitor lysophagy. Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).
- Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
- Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
- Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).
