Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi
Summary
Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Sıvı-elektron mikroskobuna (sıvı-EM) olan ilgi, bilim adamlarının artık nano ölçekte gerçek zamanlı süreçleri gözlemleyebildikleri için son yıllarda fırladı. Yüksek çözünürlüklü kriyo-EM bilgisinin dinamik gözlemlerle eşleştirilmesi son derece arzu edilir, çünkü birçok olay hızlı zaman ölçeklerinde meydana gelir – milisaniye aralığında veya daha hızlı. Esnek yapılar hakkında gelişmiş bilgi, SARS-CoV-2 gibi ortaya çıkan patojenlerle mücadele etmek için yeni reaktiflerin tasarımına da yardımcı olabilir. Daha da önemlisi, biyolojik materyalleri akışkan bir ortamda görüntülemek, insan vücudundaki performanslarına benzersiz bir bakış sağlar. Burada, sıvı ve vitreus buzundaki virüs gruplarının nano ölçekli özelliklerini araştırmak için yeni geliştirilen yöntemler sunulmaktadır. Bu amaca ulaşmak için, model sistemler olarak iyi tanımlanmış örnekler kullanılmıştır. Numune hazırlama yöntemlerinin yan yana karşılaştırmaları ve temsili yapısal bilgiler sunulmaktadır. Alt nanometre özellikleri, ~ 3.5-Å-10 şaralığında çözülen yapılar için gösterilmiştir. Bu tamamlayıcı çerçeveyi destekleyen diğer yeni sonuçlar, aşı adaylarının dinamik içgörülerini ve sıvı içinde görüntülenen antikor bazlı tedavileri içermektedir. Genel olarak, bu korelasyon uygulamaları, moleküler dinamikleri görselleştirme yeteneğimizi geliştirerek, insan sağlığı ve hastalıklarında kullanımları için benzersiz bir bağlam sağlar.
Introduction
Biyomedikal araştırmalar, yeni teknolojilerin geliştirilmesi yoluyla insan sağlığı ve hastalıkları hakkındaki anlayışımızı geliştirir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme, nanodünyaya bakışımızı dönüştürüyor – hücreleri ve moleküllerizarif ayrıntılarla 1,2,3,4,5 olarak incelememize izin veriyor. Yumuşak polimerler, protein düzenekleri veya insan virüsleri gibi dinamik bileşenlerin statik bilgileri, karmaşık anlatılarının yalnızca sınırlı bir görüntüsünü ortaya koymaktadır. Moleküler varlıkların nasıl çalıştığını daha iyi anlamak için, yapıları ve işlevleri ortaklaşa araştırılmalıdır.
Atomik olarak ince grafen veya silikon bazlı mikroçipler gibi malzemelerin üretimindeki son gelişmeler, iletim elektron mikroskoplarını (TEM’ler) kullanarak gerçek zamanlı yapı-fonksiyon analizi için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu malzemeler, canlı EM görüntüleme 6,7,8,9,10,11 için hermetik olarak kapatılmış odalar oluşturabilir. Oda sıcaklığının kriyo-EM ile ilişkili olduğu yeni sıvı-EM alanı, çözeltideki sert veya yumuşak malzemelerin benzeri görülmemiş görüntülerini sunarak, bilim adamlarının numunelerinin yapısını ve dinamiklerini aynı anda incelemelerine olanak tanır. Sıvı-EM uygulamaları, kanser kök hücreleri ile etkileşime giren terapötik nanopartiküllerin gerçek zamanlı kayıtlarını ve viral patojenlerin moleküler karmaşıklıklarındaki değişiklikleri içerir12,13,14.
Metodolojik ilerlemelerin kriyo-EM alanındaki çözünürlük devrimini teşvik etmesi gibi, sıvı-EM’nin bilimsel topluluk için yüksek verimli bir araç olarak kullanımını genişletmek için yeni tekniklere ve yöntemlere ihtiyaç vardır. Burada sunulan yöntemlerin genel amacı, sıvı-EM numune hazırlama protokollerini kolaylaştırmaktır. Geliştirilen tekniklerin arkasındaki mantık, hem sıvı hem de kriyo-EM veri toplama için uygun yeni mikroçip tasarımları ve otomatik yükleyici cihazlar kullanmaktır (Şekil 1)7,14,15,16,17. Montajlar, seans başına birden fazla numuneyi veya bir F200C TEM’i barındırabilen Krios gibi otomatik cihazlar için standart ızgara klipsleri kullanılarak mekanik olarak kapatılmıştır (Şekil 2). Bu metodoloji, gerçek zamanlı malzeme analizi için daha geniş amaçlar gösteren standart kriyo-EM uygulamalarının ötesinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımını genişletir.
Mevcut video makalesinde, ticari olarak temin edilebilen numune tutucuları olan ve olmayan sıvı içinde virüs montajlarının hazırlanması için protokoller sunulmaktadır. Sıvı-EM için özel numune tutucuyu kullanan ince sıvı numuneler, kriyo-EM numuneleriyle karşılaştırılabilir yapısal bilgilerin yanı sıra numunelerin dinamik içgörülerini de sağlayabilir. Ayrıca, yüksek verimli rutinler için otomatik yükleyici araçlarını kullanarak sıvı numuneleri hazırlama yöntemleri de gösterilmiştir. Diğer tekniklere göre en büyük avantajı, otomatik numune üretiminin, kullanıcının veri toplamadan önce numunelerini optimum kalınlık ve elektron dozu için hızlı bir şekilde değerlendirmesine izin vermesidir. Bu tarama tekniği, sıvı veya buz12,14,18,19’daki gerçek zamanlı kayıtlar için ideal alanları hızlı bir şekilde tanımlar. 3D yapı tayini amacıyla, sıvı-EM, kriyo-EM’de uygulanan köklü kriyo-EM yöntemlerini tamamlayabilir. Geleneksel TEM veya kriyo-EM teknolojilerini kullanan okuyucular, numunelerinin mevcut stratejilerini tamamlayacak şekilde yeni, dinamik gözlemlerini sağlamak için sıvı-EM iş akışlarını kullanmayı düşünebilirler.
Bu protokolde kullanılan virüs örnekleri, hediye olarak elde edilen ve standart koşullar altında kültürlenen saflaştırılmış adeno ilişkili virüs alt tip 3’ü (AAV) içerir12. Ayrıca, COVID-19 hastalarının serumundan türetilen ve ticari bir kaynaktan elde edilen bulaşıcı olmayan SARSCoV-2 alt viral derlemeleri de kullanılmıştır. Son olarak, saflaştırılmış simian rotavirüs (SA11 suşu) çift katmanlı parçacıklar (DLP’ler) Wake Forest Üniversitesi’ndeki Dr. Sarah M. McDonald Esstman’ın laboratuvarından elde edildi ve standart koşullar 6,17 kullanılarak kültürlendi. Burada açıklanan yazılım paketleri ücretsiz olarak mevcuttur ve bağlantılar Malzeme Tablosu bölümünde verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kriyo-EM alanından uyarlanmış yeni otomatik araçlar ve teknolojiler kullanarak mevcut sıvı-EM iş akışlarını kolaylaştırmak için yeni fırsatlar sunulmaktadır. Yeni mikroçipli sandviç tekniğini içeren uygulamalar, sıvı veya vitreus buzunda yüksek çözünürlüklü görüntüleme analizine olanak sağladıkları için diğer yöntemlere göre önemlidir. Protokoldeki en kritik adımlardan biri, nano ölçekte zarif ayrıntıları görselleştirmek için ideal sıvı kalınlığına sahip örnekler ü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, saflaştırılmış AAV-3 sağladığı için Dr. Luk H. Vandenberghe’ye (Harvard Tıp Fakültesi, Oftalmoloji Bölümü) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Kanser Enstitüsü (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 – D.F.K.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
