液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩
Summary
ここでは、透過型電子顕微鏡を使用してナノスケールでの液体EMおよびクライオEM分析に適したウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
液体電子顕微鏡(液体EM)への関心は、科学者がナノスケールでリアルタイムのプロセスを観察できるようになったため、近年急上昇しています。高解像度のクライオEM情報と動的観測を組み合わせることは、ミリ秒以上の速いタイムスケールで多くのイベントが発生するため、非常に望ましいです。柔軟な構造に関する知識の向上は、SARS-CoV-2などの新たな病原体と戦うための新しい試薬の設計にも役立ちます。さらに重要なことに、流動環境で生物学的材料を見ると、人体におけるそれらの性能を垣間見ることができます。ここでは、液体およびガラス質氷中のウイルス集合体のナノスケールの特性を調べるために新しく開発された方法を示します。この目標を達成するために、明確に定義されたサンプルがモデルシステムとして使用されました。サンプル調製方法と代表的な構造情報を並べて比較します。サブナノメートルの特徴は、~3.5-Å-10 Åの範囲で分解された構造について示されています。この補完的なフレームワークをサポートする他の最近の結果には、ワクチン候補の動的な洞察と液体で画像化された抗体ベースの治療法が含まれます。全体として、これらの相関アプリケーションは、分子動力学を視覚化する能力を向上させ、人間の健康と病気での使用に関する独自のコンテキストを提供します。
Introduction
生物医学研究は、新技術の開発を通じて人間の健康と病気についての理解を深めます。高解像度イメージングは、ナノワールドに対する私たちの見方を変えており、細胞や分子を絶妙な詳細で研究することを可能にします1,2,3,4,5。ソフトポリマー、タンパク質集合体、ヒトウイルスなどの動的コンポーネントの静的な情報は、それらの複雑な物語の限られたスナップショットしか明らかにしません。分子実体がどのように機能するかをよりよく理解するためには、それらの構造と機能を共同で調査する必要があります。
原子レベルで薄いグラフェンやシリコンベースのマイクロチップなどの材料の製造における最近の進歩は、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用したリアルタイムの構造機能解析の新しい機会を提供します。これらの材料は、ライブEMイメージング6、7、8、9、10、11用の密閉チャンバーを作成できます。室温がクライオEMと相関する液体EMの新しい分野は、溶液中の硬質または軟質材料の前例のないビューを提供し、科学者が標本の構造とダイナミクスを同時に研究することを可能にします。液体EMアプリケーションには、癌幹細胞と相互作用する治療用ナノ粒子のリアルタイム記録や、ウイルス病原体の分子的複雑さの変化が含まれます12,13,14。
方法論の進歩がクライオEM分野の分解能革命に拍車をかけたように、科学界のハイスループットツールとしての液体EMの使用を拡大するには、新しい技術と方法が必要です。ここで紹介する方法の全体的な目標は、液体EM試料調製プロトコルを合理化することです。開発された技術の背後にある理論的根拠は、液体とクライオEMの両方のデータ収集に適した新しいマイクロチップ設計とオートローダーデバイスを採用することです(図1)7、14、15、16、17。アセンブリは、セッションごとに複数のサンプルを収容できるKriosやF200C TEMなどの自動機器用の標準グリッドクリップを使用して機械的にシールされています(図2)。この方法論は、標準的なクライオEMアプリケーションを超えて高解像度イメージングの使用を拡大し、リアルタイムの材料分析のより広い目的を実証します。
現在のビデオ記事では、市販の検体ホルダーの有無にかかわらず、液体中のウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルが提示されています。液体EM専用の試料ホルダーを使用することで、薄い液体試料は、クライオEM試料に匹敵する構造情報と、試料の動的な洞察を得ることができます。また、ハイスループットルーチン用のオートローダーツールを使用して液体試料を準備する方法も実証されています。他の技術に対する主な利点は、自動試料作製により、データ収集前にサンプルの最適な厚さと電子投与量を迅速に評価できることです。このスクリーニング技術は、液体または氷中のリアルタイム記録に理想的な領域を迅速に特定します12、14、18、19。3D構造決定の目的で、液体EMは、クライオEMで実装されている長年のクライオEMメソッドを補完する可能性があります。従来のTEMまたはクライオEM技術を採用している読者は、液体EMワークフローを使用して、現在の戦略を補完する方法でサンプルの新しい動的観察を提供することを検討できます。
このプロトコルで使用されるウイルスサンプルには、ギフトとして取得され、標準条件下で培養された精製アデノ随伴ウイルスサブタイプ3(AAV)が含まれます12。また、COVID-19患者の血清12に由来し、市販の供給源から入手した非感染性SARS CoV-2サブウイルスアセンブリも使用されました。最後に、精製されたサルロタウイルス(SA11株)二重層粒子(DLP)をウェイクフォレスト大学のSarah M. McDonald Esstman博士の研究室から入手し、標準条件6,17を用いて培養した。ここで説明するソフトウェアパッケージは無料で入手でき、リンクは「材料表」セクションにあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
クライオEM分野から適応された新しい自動化ツールと技術を使用することにより、現在の液体EMワークフローを合理化する新しい機会が提示されます。新しいマイクロチップサンドイッチ技術を含むアプリケーションは、液体またはガラス質の氷中での高解像度のイメージング分析を可能にするため、他の方法に関して重要です。プロトコルの最も重要なステップの1つは、ナノスケールレベ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Luk H. Vandenberghe博士(ハーバード大学医学部眼科)が精製AAV-3を提供したことを称賛しています。この研究は、国立衛生研究所および国立がん研究所(R01CA193578、R01CA227261、R01CA219700からD.F.K.)の支援を受けた。
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
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