Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs
Summary
Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.
Abstract
De interesse in vloeistof-elektronenmicroscopie (liquid-EM) is de afgelopen jaren omhooggeschoten omdat wetenschappers nu real-time processen op nanoschaal kunnen observeren. Het is uiterst wenselijk om cryo-EM-informatie met hoge resolutie te koppelen aan dynamische waarnemingen, omdat veel gebeurtenissen zich op snelle tijdschalen voordoen – in het millisecondebereik of sneller. Verbeterde kennis van flexibele structuren kan ook helpen bij het ontwerpen van nieuwe reagentia om opkomende pathogenen, zoals SARS-CoV-2, te bestrijden. Wat nog belangrijker is, het bekijken van biologische materialen in een vloeibare omgeving biedt een unieke glimp van hun prestaties in het menselijk lichaam. Hier worden nieuw ontwikkelde methoden gepresenteerd om de nanoschaaleigenschappen van virusassemblages in vloeibaar en glasachtig ijs te onderzoeken. Om dit doel te bereiken, werden goed gedefinieerde monsters gebruikt als modelsystemen. Vergelijkingen van monstervoorbereidingsmethoden en representatieve structurele informatie worden naast elkaar gepresenteerd. Sub-nanometerkenmerken worden weergegeven voor structuren die zijn opgelost in het bereik van ~ 3,5-Å-10 Å. Andere recente resultaten die dit complementaire kader ondersteunen, omvatten dynamische inzichten van vaccinkandidaten en op antilichamen gebaseerde therapieën afgebeeld in vloeistof. Over het algemeen bevorderen deze correlatieve toepassingen ons vermogen om moleculaire dynamica te visualiseren en bieden ze een unieke context voor hun gebruik in de menselijke gezondheid en ziekte.
Introduction
Biomedisch onderzoek verbetert ons begrip van de menselijke gezondheid en ziekte door de ontwikkeling van nieuwe technologieën. Beeldvorming met hoge resolutie transformeert ons beeld van de nanowereld – waardoor we cellen en moleculen in prachtig detailkunnen bestuderen 1,2,3,4,5. Statische informatie van dynamische componenten zoals zachte polymeren, eiwitassemblages of menselijke virussen onthult slechts een beperkte momentopname van hun complexe verhaal. Om beter te begrijpen hoe moleculaire entiteiten werken, moeten hun structuur en functie gezamenlijk worden onderzocht.
Recente ontwikkelingen in de productie van materialen zoals atomair dun grafeen of op silicium gebaseerde microchips bieden nieuwe mogelijkheden voor real-time structuurfunctieanalyse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopen (TEMs). Deze materialen kunnen hermetisch afgesloten kamers creëren voor live EM-beeldvorming 6,7,8,9,10,11. Het nieuwe veld van liquid-EM, de kamertemperatuurcorrelecorrel met cryo-EM, biedt ongekende weergaven van harde of zachte materialen in oplossing, waardoor wetenschappers tegelijkertijd de structuur en dynamiek van hun monster kunnen bestuderen. Liquid-EM-toepassingen omvatten real-time opnames van therapeutische nanodeeltjes die interageren met kankerstamcellen en veranderingen in de moleculaire fijne kneepjes van virale pathogenen 12,13,14.
Net zoals methodologische vooruitgang de resolutierevolutie op het gebied van cryo-EM heeft gestimuleerd, zijn nieuwe technieken en methoden nodig om het gebruik van liquid-EM als een high-throughput tool voor de wetenschappelijke gemeenschap uit te breiden. Het algemene doel van de hier gepresenteerde methoden is om de protocollen voor de voorbereiding van vloeibare EM-monsters te stroomlijnen. De reden achter de ontwikkelde technieken is om nieuwe microchipontwerpen en autoloader-apparaten te gebruiken, geschikt voor zowel vloeistof- als cryo-EM-gegevensverzameling (figuur 1) 7,14,15,16,17. De assemblages worden mechanisch afgedicht met behulp van standaard rasterclips voor geautomatiseerde instrumenten, zoals de Krios, die plaats biedt aan meerdere monsters per sessie of een F200C TEM (figuur 2). Deze methodologie breidt het gebruik van beeldvorming met hoge resolutie verder uit dan standaard cryo-EM-toepassingen die bredere doeleinden voor real-time materiaalanalyse demonstreren.
In het huidige videoartikel worden protocollen gepresenteerd voor het bereiden van virusassemblages in vloeistof met en zonder in de handel verkrijgbare monsterhouders. Met behulp van de gespecialiseerde monsterhouder voor liquid-EM kunnen dunne vloeibare monsters structurele informatie bieden die vergelijkbaar is met cryo-EM-monsters, evenals dynamische inzichten van de monsters. Ook worden methoden gedemonstreerd voor het voorbereiden van vloeibare monsters met behulp van autoloader-gereedschappen voor routines met hoge doorvoer. Het grote voordeel ten opzichte van andere technieken is dat geautomatiseerde monsterproductie de gebruiker in staat stelt om zijn monsters snel te beoordelen op optimale dikte en elektronendosering voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Deze screeningstechniek identificeert snel ideale gebieden voor real-time opnames in vloeistof of ijs 12,14,18,19. Met het oog op de bepaling van de 3D-structuur kan liquid-EM een aanvulling vormen op de reeds lang bestaande cryo-EM-methoden die in cryo-EM zijn geïmplementeerd. Lezers die conventionele TEM- of cryo-EM-technologieën gebruiken, kunnen overwegen om liquid-EM-workflows te gebruiken om nieuwe, dynamische observaties van hun monsters te bieden op een manier die hun huidige strategieën aanvult.
Virusmonsters die in dit protocol worden gebruikt, omvatten gezuiverde adeno-geassocieerde virussubtype 3 (AAV) verkregen als een geschenk en gekweekt onder standaardomstandigheden12. Ook werden niet-infectieuze SARS CoV-2 subvirale assemblages gebruikt die zijn afgeleid van het serum van COVID-19-patiënten12 en verkregen uit een commerciële bron. Ten slotte werden gezuiverde simian rotavirus (SA11-stam) dubbellaagse deeltjes (DLPs) verkregen uit het laboratorium van Dr. Sarah M. McDonald Esstman aan de Wake Forest University en gekweekt met behulp van standaardomstandigheden 6,17. Softwarepakketten die hier worden beschreven, zijn vrij beschikbaar en de koppelingen zijn beschikbaar in de sectie Materiaaltabel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er worden nieuwe mogelijkheden geboden om de huidige liquid-EM-workflows te stroomlijnen door gebruik te maken van nieuwe geautomatiseerde tools en technologieën die zijn aangepast aan het cryo-EM-veld. Toepassingen met betrekking tot de nieuwe microchip sandwichtechniek zijn belangrijk met betrekking tot andere methoden omdat ze beeldvormingsanalyse met hoge resolutie in vloeibaar of glasachtig ijs mogelijk maken. Een van de meest kritieke stappen in het protocol is het produceren van monsters met de ideale vloeistofdi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) voor het verstrekken van gezuiverde AAV-3. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health en het National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 tot D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
