Summary

Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio

Published: July 20, 2022
doi:

Summary

Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l’analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

L’interesse per la microscopia a elettroni liquidi (liquid-EM) è salito alle stelle negli ultimi anni, poiché gli scienziati possono ora osservare i processi in tempo reale su scala nanometrica. È estremamente desiderabile accoppiare informazioni crio-EM ad alta risoluzione con osservazioni dinamiche poiché molti eventi si verificano su scale temporali rapide – nell’intervallo di millisecondi o più velocemente. Una migliore conoscenza delle strutture flessibili può anche aiutare nella progettazione di nuovi reagenti per combattere i patogeni emergenti, come SARS-CoV-2. Ancora più importante, la visualizzazione di materiali biologici in un ambiente fluido offre uno sguardo unico delle loro prestazioni nel corpo umano. Qui sono presentati metodi recentemente sviluppati per studiare le proprietà su scala nanometrica degli assemblaggi di virus nel ghiaccio liquido e vetroso. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati utilizzati campioni ben definiti come sistemi modello. Vengono presentati confronti affiancati dei metodi di preparazione dei campioni e delle informazioni strutturali rappresentative. Le caratteristiche sub-nanometriche sono mostrate per le strutture risolte nell’intervallo di ~ 3,5-Å-10 Å. Altri risultati recenti che supportano questo quadro complementare includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini e delle terapie basate su anticorpi visualizzate in liquido. Nel complesso, queste applicazioni correlate migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per il loro uso nella salute umana e nelle malattie.

Introduction

La ricerca biomedica migliora la nostra comprensione della salute umana e delle malattie attraverso lo sviluppo di nuove tecnologie. L’imaging ad alta risoluzione sta trasformando la nostra visione del nanomondo, permettendoci di studiare cellule e molecole in dettaglio squisito 1,2,3,4,5. Le informazioni statiche di componenti dinamici come polimeri molli, assemblaggi proteici o virus umani rivelano solo un’istantanea limitata della loro complessa narrazione. Per comprendere meglio come operano le entità molecolari, la loro struttura e funzione devono essere studiate congiuntamente.

I recenti progressi nella produzione di materiali come il grafene atomicamente sottile o i microchip a base di silicio offrono nuove opportunità per l’analisi struttura-funzione in tempo reale utilizzando microscopi elettronici a trasmissione (TEM). Questi materiali possono creare camere ermeticamente sigillate per l’imaging EM live 6,7,8,9,10,11. Il nuovo campo di liquido-EM, la temperatura ambiente correlata alla crio-EM, fornisce una visione senza precedenti di materiali duri o morbidi in soluzione, consentendo agli scienziati di studiare simultaneamente la struttura e la dinamica del loro campione. Le applicazioni liquid-EM includono registrazioni in tempo reale di nanoparticelle terapeutiche che interagiscono con le cellule staminali tumorali e cambiamenti nelle complessità molecolari dei patogeni virali12,13,14.

Proprio come i progressi metodologici hanno stimolato la rivoluzione della risoluzione nel campo della crio-EM, sono necessarie nuove tecniche e metodi per estendere l’uso di liquid-EM come strumento ad alto rendimento per la comunità scientifica. L’obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di semplificare i protocolli di preparazione dei campioni liquidi-EM. La logica alla base delle tecniche sviluppate è quella di impiegare nuovi progetti di microchip e dispositivi di autoloader, adatti sia per la raccolta di dati liquidi che crio-EM (Figura 1) 7,14,15,16,17. I gruppi sono sigillati meccanicamente utilizzando clip a griglia standard per strumenti automatizzati, come Krios, che possono ospitare più campioni per sessione o un TEM F200C (Figura 2). Questa metodologia espande l’uso dell’imaging ad alta risoluzione oltre le applicazioni crio-EM standard, dimostrando scopi più ampi per l’analisi dei materiali in tempo reale.

Nell’attuale articolo video, vengono presentati i protocolli per la preparazione di assemblaggi di virus in liquido con e senza portacampioni disponibili in commercio. Utilizzando il portacampioni specializzato per liquido-EM, i campioni liquidi sottili possono fornire informazioni strutturali paragonabili ai campioni crio-EM, nonché approfondimenti dinamici dei campioni. Vengono inoltre dimostrati metodi per la preparazione di campioni liquidi utilizzando strumenti di caricamento automatico per routine ad alta produttività. Il vantaggio principale rispetto ad altre tecniche è che la produzione automatizzata di campioni consente all’utente di valutare rapidamente i propri campioni per lo spessore e il dosaggio di elettroni ottimali prima della raccolta dei dati. Questa tecnica di screening identifica rapidamente le aree ideali per le registrazioni in tempo reale in liquido o ghiaccio12,14,18,19. Ai fini della determinazione della struttura 3D, liquid-EM può integrare i metodi crio-EM di lunga data implementati nella crio-EM. I lettori che impiegano tecnologie TEM o crio-EM convenzionali possono prendere in considerazione l’utilizzo di flussi di lavoro liquid-EM per fornire nuove osservazioni dinamiche dei loro campioni in un modo che integri le loro attuali strategie.

I campioni di virus utilizzati in questo protocollo includono il sottotipo 3 del virus adeno-associato purificato (AAV) ottenuto come dono e coltivato in condizioni standard12. Sono stati utilizzati anche assemblaggi subvirali non infettivi di SARS CoV-2 derivati dal siero di pazienti COVID-1912 e ottenuti da una fonte commerciale. Infine, le particelle purificate a doppio strato (DLP) del rotavirus delle scimmie (ceppo SA11) sono state ottenute dal laboratorio della dottoressa Sarah M. McDonald Esstman presso la Wake Forest University e coltivate utilizzando condizioni standard 6,17. I pacchetti software qui descritti sono disponibili gratuitamente e i collegamenti sono stati forniti nella sezione Tabella dei materiali.

Protocol

1. Caricamento del portacampioni per liquid-EM Pulire i microchip di nitruro di silicio (SiN) incubando ciascun chip in 150 ml di acetone per 2 minuti, seguito dall’incubazione in 150 ml di metanolo per 2 minuti. Lasciare asciugare i trucioli nel flusso d’aria laminare. Pulire al plasma i trucioli essiccati utilizzando uno strumento a scarica di bagliore operante in condizioni standard di 30 W, 15 mA per 45 s utilizzando gas Argon. Caricare un microchip a base asciutta nella…

Representative Results

Un TEM liquido funzionante a 200 kV è stato utilizzato per tutti gli esperimenti di imaging liquid-EM e un crio-TEM funzionante a 300 kV è stato utilizzato per tutta la raccolta di dati crio-EM. Vengono presentate immagini rappresentative e strutture di più virus per dimostrare l’utilità dei metodi in vari soggetti del test. Questi includono il virus adeno-associato ricombinante sottotipo 3 (AAV), gli assemblaggi subvirali SARS-CoV-2 derivati dal siero del paziente e le particelle a doppio strato (DLP) del rotavirus …

Discussion

Vengono presentate nuove opportunità per semplificare gli attuali flussi di lavoro liquid-EM utilizzando nuovi strumenti automatizzati e tecnologie adattate dal campo crio-EM. Le applicazioni che coinvolgono la nuova tecnica a sandwich di microchip sono significative rispetto ad altri metodi perché consentono l’analisi di imaging ad alta risoluzione in ghiaccio liquido o vetroso. Uno dei passaggi più critici del protocollo è la produzione di campioni con lo spessore liquido ideale per visualizzare dettagli squisiti a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono il Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Dipartimento di Oftalmologia) per aver fornito AAV-3 purificato. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health e dal National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).

Materials

Acetone Fisher Scientific  A11-1 1 Liter
Autoloader clipping tool ThermoFisher Scientific N/A Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips ThermoFisher Scientific N/A top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids Electron Microcopy Sciences CF400-AU-50 400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum RayBiotech CoV-Pos-S-500 500 microliters of PCR+ serum
Methanol Fisher Scientific  A412-1 1 Liter
Microwell-integrad microchips Protochips, Inc. EPB-42A1-10 10×10-mm window arrays
TEMWindows microchips Simpore Inc. SN100-A10Q33B 9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips Simpore, Inc.  SN100-A05Q33A 9 small windows, 5-nm thick
Top microchips Protochips, Inc. EPT-50W 500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detector Direct Electron 6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector ThermoFisher Scientific 14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc.  Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot ThermoFisher Scientific state-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM ThermoFisher Scientific 200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3 ThermoFisher Scientific 300 kV; Cryo-TEM
Freely available software Website link Comments (optional)
cryoSPARC https://cryosparc.com/ other image processing software
CTFFIND4 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 CTF finding program
MotionCorr2 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ molecular structure analysis software package

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DiCecco, L., Berry, S., Jonaid, G. M., Solares, M. J., Kaylor, L., Gray, J. L., Bator, C., Dearnaley, W. J., Spilman, M., Dressel-Dukes, M. J., Grandfield, K., McDonald Esstman, S. M., Kelly, D. F. Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice. J. Vis. Exp. (185), e63856, doi:10.3791/63856 (2022).

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