Faire progresser l’imagerie haute résolution des assemblages de virus dans le liquide et la glace
Summary
Ici, des protocoles sont décrits pour préparer des assemblages de virus adaptés à l’analyse liquide-EM et cryo-EM à l’échelle nanométrique en utilisant la microscopie électronique à transmission.
Abstract
L’intérêt pour la microscopie électronique liquide (EM liquide) a explosé ces dernières années, car les scientifiques peuvent maintenant observer des processus en temps réel à l’échelle nanométrique. Il est extrêmement souhaitable de coupler des informations cryo-EM à haute résolution avec des observations dynamiques, car de nombreux événements se produisent à des échelles de temps rapides – de l’ordre de la milliseconde ou plus. Une meilleure connaissance des structures flexibles peut également aider à la conception de nouveaux réactifs pour lutter contre les agents pathogènes émergents, tels que le SRAS-CoV-2. Plus important encore, l’observation des matériaux biologiques dans un environnement fluide donne un aperçu unique de leur performance dans le corps humain. Les méthodes nouvellement développées ici sont présentées pour étudier les propriétés à l’échelle nanométrique des assemblages de virus dans la glace liquide et vitreuse. Pour atteindre cet objectif, des échantillons bien définis ont été utilisés comme systèmes modèles. Des comparaisons côte à côte des méthodes de préparation des échantillons et des informations structurelles représentatives sont présentées. Les caractéristiques sub-nanométriques sont montrées pour les structures résolues dans la plage de ~3,5-Å-10 Å. Parmi les autres résultats récents qui soutiennent ce cadre complémentaire, citons les connaissances dynamiques des candidats vaccins et des thérapies à base d’anticorps imagées dans un liquide. Dans l’ensemble, ces applications corrélatives font progresser notre capacité à visualiser la dynamique moléculaire, fournissant un contexte unique pour leur utilisation dans la santé et la maladie humaines.
Introduction
La recherche biomédicale améliore notre compréhension de la santé et des maladies humaines grâce au développement de nouvelles technologies. L’imagerie à haute résolution transforme notre vision du nanomonde – nous permettant d’étudier les cellules et les molécules dans les moindres détails 1,2,3,4,5. L’information statique des composants dynamiques tels que les polymères mous, les assemblages de protéines ou les virus humains ne révèle qu’un instantané limité de leur récit complexe. Pour mieux comprendre le fonctionnement des entités moléculaires, leur structure et leur fonction doivent être étudiées conjointement.
Les progrès récents dans la production de matériaux tels que le graphène atomiquement mince ou les micropuces à base de silicium offrent de nouvelles possibilités d’analyse structure-fonction en temps réel à l’aide de microscopes électroniques à transmission (MET). Ces matériaux peuvent créer des chambres hermétiquement scellées pour l’imagerie EM en direct 6,7,8,9,10,11. Le nouveau champ de liquide-EM, le corrélat à température ambiante à cryo-EM, fournit des vues sans précédent des matériaux durs ou mous en solution, permettant aux scientifiques d’étudier simultanément la structure et la dynamique de leur échantillon. Les applications EM liquides comprennent des enregistrements en temps réel de nanoparticules thérapeutiques interagissant avec les cellules souches cancéreuses ainsi que des changements dans les subtilités moléculaires des pathogènes viraux12,13,14.
Tout comme les progrès méthodologiques ont stimulé la révolution de la résolution dans le domaine de la cryo-EM, de nouvelles techniques et méthodes sont nécessaires pour étendre l’utilisation de la ME liquide en tant qu’outil à haut débit pour la communauté scientifique. L’objectif global des méthodes présentées ici est de rationaliser les protocoles de préparation des échantillons liquides. La raison d’être des techniques développées est d’utiliser de nouvelles conceptions de micropuces et de dispositifs de chargement automatique, adaptés à la collecte de données liquides et cryo-EM (Figure 1)7,14,15,16,17. Les assemblages sont scellés mécaniquement à l’aide de clips de grille standard pour les instruments automatisés, tels que le Krios, qui peut accueillir plusieurs échantillons par session ou un TEM F200C (Figure 2). Cette méthodologie étend l’utilisation de l’imagerie haute résolution au-delà des applications cryo-EM standard, démontrant des objectifs plus larges pour l’analyse des matériaux en temps réel.
Dans le présent article vidéo, des protocoles sont présentés pour la préparation d’assemblages de virus dans un liquide avec et sans porte-échantillons disponibles dans le commerce. En utilisant le porte-échantillon spécialisé pour les échantillons liquides-EM, les échantillons liquides minces peuvent fournir des informations structurelles comparables aux échantillons cryo-EM, ainsi que des informations dynamiques sur les échantillons. Des méthodes de préparation d’échantillons liquides à l’aide d’outils de chargement automatique pour les routines à haut débit ont également été démontrées. Le principal avantage par rapport aux autres techniques est que la production automatisée d’échantillons permet à l’utilisateur d’évaluer rapidement ses échantillons pour une épaisseur et un dosage d’électrons optimaux avant la collecte des données. Cette technique de criblage identifie rapidement les zones idéales pour les enregistrements en temps réel dans un liquide ou de la glace12,14,18,19. Aux fins de la détermination de la structure 3D, la solution EM liquide peut compléter les méthodes cryo-EM établies de longue date mises en œuvre dans la cryo-EM. Les lecteurs utilisant des technologies conventionnelles de GDT ou de cryo-EM peuvent envisager d’utiliser des flux de travail liquide-EM pour fournir de nouvelles observations dynamiques de leurs échantillons d’une manière qui complète leurs stratégies actuelles.
Les échantillons de virus utilisés dans ce protocole comprennent le virus adéno-associé purifié de sous-type 3 (AAV) obtenu en cadeau et cultivé dans des conditions standard12. Des assemblages sous-viraux non infectieux du SRAS-CoV-2 dérivés du sérum de patients atteints de COVID-1912 et obtenus d’une source commerciale ont également été utilisés. Enfin, des particules à double couche (DLP) purifiées du rotavirus simien (souche SA11) ont été obtenues dans le laboratoire du Dr Sarah M. McDonald Esstman à l’Université de Wake Forest et cultivées en utilisant des conditions standard 6,17. Les progiciels décrits ici sont disponibles gratuitement et les liens ont été fournis dans la section Tableau des matériaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nouvelles opportunités sont présentées pour rationaliser les flux de travail actuels de liquide EM en utilisant de nouveaux outils automatisés et des technologies adaptées du domaine cryo-EM. Les applications impliquant la nouvelle technique sandwich par micropuce sont importantes par rapport à d’autres méthodes, car elles permettent une analyse d’imagerie à haute résolution dans la glace liquide ou vitreuse. L’une des étapes les plus critiques du protocole consiste à produire des spécimens avec l’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Département d’ophtalmologie) pour avoir fourni AAV-3 purifié. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health et le National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 à D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
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