تحديد نشاط انحلال الدم والفوسفوليباز في المستخلصات الخام من شقائق النعمان البحرية عن طريق المقايسات الحيوية المباشرة
Summary
هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على مستخلص السم الخام من شقائق النعمان البحرية والكشف عن نشاطه الانحلالي والفوسفوليباز.
Abstract
يتضمن تكوين سم شقائق النعمان البحرية جزيئات متعددة الببتيد وغير البروتينات. تتمتع مكونات التحلل الخلوي بإمكانات عالية في مجال التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي لتصميم أدوات جزيئية جديدة. يقع سم شقائق النعمان البحرية في الخلايا الغدية من الأديم الخارجي والهياكل دون الخلوية التي تسمى الأكياس الخيطية ، وكلاهما موزع في جميع أنحاء جسم شقائق النعمان في البحر. هذه الخاصية تنطوي على تحديات لأنه يجب تحليل الخلايا والكيس الخيطي لإطلاق مكونات السم مع جزيئات أخرى غير سامة. لذلك ، أولا ، يتم اشتقاق السم من مستخلص خام (خليط من جزيئات مختلفة ومتنوعة وحطام الأنسجة). الخطوة التالية هي الكشف عن الببتيدات المتعددة ذات الأنشطة الحيوية المحددة. هنا ، نصف استراتيجية فعالة للحصول على مستخلص خام شقائق النعمان البحرية والفحص الحيوي لتحديد وجود السيتوليسين. تتضمن الخطوة الأولى تقنيات غير مكلفة ومباشرة (دورة التحريك والتجميد والذوبان) لإطلاق السيتوليسينات. حصلنا على أعلى نشاط تحلل الخلايا والبروتين (~ 500 ملغ من البروتين من 20 غرام من الوزن الجاف). بعد ذلك ، تم تحليل تعقيد الببتيد المتعدد للمستخلص بواسطة SDS-PAGE gel للكشف عن البروتينات ذات الأوزان الجزيئية بين 10 kDa و 250 kDa. في فحص الانحلال ، استخدمنا خلايا الدم الحمراء للأغنام وحددنا HU50 (11.1 ± 0.3 ميكروغرام / مل). في المقابل ، تم تحديد وجود الفوسفوليباز في المستخلص الخام باستخدام صفار البيض كركيزة في وسط صلب مع الأغاروز. بشكل عام ، تستخدم هذه الدراسة بروتوكولا فعالا وغير مكلف لإعداد المستخلص الخام وتطبق مقايسات حيوية قابلة للتكرار لتحديد السيتوليسين ، والجزيئات ذات الاهتمامات التكنولوجية الحيوية والطبية الحيوية.
Introduction
الحيوانات البحرية هي مصدر غني للمركبات النشطة بيولوجيا. في العقود الأخيرة ، اجتذب تكوين سم شقائق النعمان البحرية اهتماما علميا لأنه يضم مجموعة متنوعة من الببتيدات المتعددة مع الانحلالية ، السامة للخلايا ، الأنزيمية (الفوسفوليباز ، البروتياز ، الكيتيناز) ، والنشاط السام للأعصاب والتأثيرات المثبطة على النشاط البروتيني1. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الببتيدات المتعددة هي مصادر محتملة لتطوير الأدوات الجزيئية في التكنولوجيا الحيوية والاستخدام العلاجي 2,3.
هناك عدد قليل من التقارير حول سم شقائق النعمان البحرية ومكوناته الجزيئية بسبب تعقيد الحصول على السم ، وحتى العزل ، وتوصيف السموم. تضمنت طرق الاستخراج المستخدمة في التقارير التحلل وإفراغ محتويات الخلايا ذات الصلة وغير المرتبطة بإنتاج السم1.
ومن الخصائص الخاصة في جميع cnidarians عدم وجود نظام لإنتاج وإطلاق السم مركزي في منطقة تشريحية واحدة. بدلا من ذلك ، فإن الأكياس الخيطية هي هياكل تحافظ على السم 4,5. أنواع أخرى من الخلايا ، تسمى خلايا غدة البشرة ، تفرز أيضا السموم ويتم توزيعها أيضا في جميع أنحاء الجسم من شقائق النعمان البحرية6.
التحدي الأول والأكثر أهمية في الحصول على السم هو توليد مستخلص مع التلاعب الكافي في العمليات اللاحقة ، دون تعطيل أو تدهور البروتينات اللابيلية. بعد ذلك ، يجب تحليل الخلايا ، والمكونات – في هذه الحالة ، يجب استخراج الببتيدات المتعددة بكفاءة وسرعة ، وتجنب التحلل البروتيني والتحلل المائي مع القضاء على المكونات الخلوية الأخرى7.
تستخدم طرق مختلفة للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية. بعضها ينطوي على التضحية بالكائن الحي بينما يسمح البعض الآخر بإبقائه على قيد الحياة. تسمح الطرق التي تنطوي على استخدام جسم الكائن الحي بالكامل بإطلاق معظم السموم من السم8 ، مقارنة بالطرق التي تبقي الكائنات الحية على قيد الحياة ، والتي تستخرج فقط بعض مكونات السم9. يتطلب تحضير المستخلص تقييم وجود وفعالية مادة ذات أهمية من خلال فحص حيوي محدد ، والذي يتضمن استراتيجيات لمراقبة الآثار الدوائية عن طريق الطرق في الجسم الحي أو في المختبر 10.
يحتوي سم شقائق النعمان البحرية على بولي ببتيدات محللة للخلايا ، وسموم تشكل المسام (PFTs) 11 ، وفوسفوليباز12 ؛ هذه الجزيئات هي نماذج في دراسة التفاعل بين البروتين والدهون ، والأدوات الجزيئية في علاج السرطان ، وأجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على المسام النانوية3. يتم تصنيف PFTs شقائق النعمان البحرية وفقا لحجمها أو وزنها الجزيئي ، من 5 kDa إلى 80 kDa. إن 20 kDa PFT ، الأكثر دراسة والمعروفة باسم الأكتينوبورين11 ، له أهمية خاصة لإمكاناته الطبية الحيوية في تطوير أدوات جزيئية للتطبيقات المحتملة مثل أجهزة الاستشعار الحيوية المضادة للسرطان ومضادات الميكروبات والمسام النانوية. وهناك سيتوليسين آخر، بما في ذلك الفوسفوليباز، وتحديدا الفوسفوليباز A2 (PLA2)13، يطلق حمضا دهنيا مستحقا ويتحلل الدهون الفوسفاتية، مما يزعزع استقرار غشاء الخلية. بسبب آلية العمل هذه ، يعد PLA2 بأن يكون نموذجا أساسيا للدراسة والتطبيقات في الأمراض الالتهابية. يمكن أن يكون بمثابة نموذج لدراسات سلوك الدهون في غشاء الخلية14.
هنا ، نصف بروتوكولا فعالا للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية Anthopleura dowii Verrill ، 1869 ، والكشف عن الهيموليسين والفوسفوليباز. كلاهما سموم ذات صلة يمكن استخدامها كقالب لتصميم أدوات جزيئية جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أدى ارتفاع الطلب على المركبات الجديدة ذات التطبيقات في مختلف مجالات العلوم والصناعة إلى دراسة السم. يمثل السم مصدرا غنيا بالجزيئات التي تعمل كقالب لتوليد أدوات جزيئية جديدة. ومع ذلك ، فإن تعقيد هذه السموم يتطلب تنفيذ والجمع بين الأساليب المختلفة للحصول عليها ودراستها.
هنا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) ، مع رقم منحة IT200819. يعترف المؤلفون لتوم موسلمان ، Rock Paper Editing ، LLC ، للتحقق من قواعد اللغة الإنجليزية لهذه المخطوطة ؛ والمساعدة التقنية المقدمة من سامانتا خيمينيز (CICESE، إنسينادا)، وخوان مانويل باربوسا كاستيلو (معهد العلوم الاجتماعية، بعثة الأمم المتحدة في أفغانستان). كما نشكر الدكتور أوغستو سيزار ليزارازو تشابارو (CEPIPSA) على حصوله على دم الأغنام. ونشكر بصفة خاصة الدكتور خوسيه سانيغر بيزا، من معهد المحاسبين القانونيين المعتمدين – بعثة الأمم المتحدة لتقديم المساعدة إلى أفغانستان، على التسهيلات التي وفرها في مختبره لتسجيل الفيديو.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
References
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
- Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
- Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
- Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).
- Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
- Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
- Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
- Hader, D., Erzinger, G. . Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).
- Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
- Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
- Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis – its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
- Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
- Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
- Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
- de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
- Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
- Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
- Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
- Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).
