Identificação da Atividade Hemolítica e Fosfolipase em Extratos Brutos de Anêmonas do Mar por Bioensaões Simples

Animais marinhos são uma rica fonte de compostos biologicamente ativos. Nas últimas décadas, a composição do veneno de anêmona marinha tem atraído atenção científica, pois compreende uma diversidade de polipeptídeos com hemolítica, citotóxica, enzimática (fosfolipase, protease, quitinase) e atividade neurotóxica e efeitos inibitórios na atividade proteolítica¹. Além disso, esses polipeptídeos são fontes potenciais para o desenvolvimento de ferramentas moleculares no uso biotecnológico e terapêutico ^2,3.

Há poucos relatos sobre o veneno de anêmona marinha e seus componentes moleculares devido à complexidade da obtenção do veneno, até mesmo do isolamento e caracterização de toxinas. Os métodos de extração utilizados nos relatórios envolveram a lise e o esvaziamento do conteúdo das células relacionadas e não relacionadas à produção^{de veneno 1}.

Uma característica particular em todos os cnidários é a ausência de um sistema de produção e liberação do veneno centralizado em uma única região anatômica. Em vez disso, os nematocistos são estruturas que mantêm o veneno ^4,5. Outros tipos de células, chamadas células da glândula epidérmica, também secretam toxinas e também são distribuídas por todo o corpo de anêmonas do mar⁶.

O primeiro e mais crucial desafio na obtenção do veneno é a geração de um extrato com manipulação suficiente em processos subsequentes, sem a inativação ou degradação de proteínas labile. Em seguida, as células devem ser liseadas, e os componentes – neste caso, os polipeptídeos devem ser extraídos de forma eficiente e rápida, evitando a proteólise e a hidrólise ao eliminar outros componentes celulares⁷.

Diferentes métodos são utilizados para obter o extrato bruto de uma anêmona marinha; alguns envolvem sacrificar o organismo, enquanto outros permitem que ele seja mantido vivo. Métodos que implicam o uso de todo o corpo do organismo permitem a liberação da maioria das toxinas do veneno⁸, em comparação com métodos que mantêm os organismos vivos, que extraem apenas alguns componentes do veneno⁹. A elaboração de um extrato requer avaliar a presença e potência de uma substância de interesse por meio de um bioensaio específico, que inclui estratégias para observar os efeitos farmacológicos pelos métodos in vivo ou in vitro ¹⁰.

O veneno de anêmona do mar contém polipeptídeos citólíticos, toxinas formadoras de poros (PFTs)¹¹ e fosfolipases¹²; essas moléculas são modelos no estudo da interação proteína-lipídica, ferramentas moleculares na terapia do câncer e biosensores à base de nanoporos³. A classificação de PFTs de anêmona marinha é realizada de acordo com seu tamanho ou peso molecular, de 5 kDa a 80 kDa. O PFT de 20 kDa, o mais estudado e conhecido como actinoporinas¹¹, é de particular interesse por seu potencial biomédico no desenvolvimento de ferramentas moleculares para possíveis aplicações como biosensores anticancerígenos, antimicrobianos e à base de nanoporos. Outra citolisina, incluindo fosfolipases, especificamente fosfolipase A2 (PLA2)¹³, libera um ácido graxo devido e hidrolisa fosfolipídios, desestabilizando a membrana celular. Devido a esse mecanismo de ação, o PLA2 promete ser um modelo essencial para o estudo e aplicações em doenças inflamatórias. Poderia servir de modelo para estudos de comportamento lipídudo na membrana^{celular 14}.

Aqui, descrevemos um protocolo eficiente para a obtenção do extrato bruto da anêmona anthopleura dowii Verrill, 1869, e a detecção de hemolises e fosfolipases. Ambas são toxinas relevantes que poderiam ser usadas como modelo para projetar novas ferramentas moleculares.