Summary

Identificatie van hemolytische en fosfolipase-activiteit in ruwe extracten van zeeanemonen door Eenvoudige Bioassays

Published: March 29, 2022
doi:

Summary

Hier beschrijven we een protocol om ruw gifextract uit zeeanemoon te verkrijgen en de hemolytische en fosfolipase-activiteit ervan te detecteren.

Abstract

De samenstelling van zeeanemoongif omvat polypeptide- en niet-eiwitmoleculen. Cytolytische componenten hebben een hoog biotechnologisch en biomedisch potentieel voor het ontwerpen van nieuwe moleculaire hulpmiddelen. Zeeanemoongif lokaliseert zich in glandulaire cellen van ectoderm en subcellulaire structuren die nematocysten worden genoemd, die beide verspreid zijn over het zeeanemoonlichaam. Deze eigenschap impliceert uitdagingen omdat de cellen en nematocysten moeten worden gelyseerd om de gifcomponenten vrij te geven met andere niet-toxische moleculen. Daarom is het gif eerst afgeleid van een ruw extract (mengsel van verschillende en diverse moleculen en weefselresten). De volgende stap is het detecteren van polypeptiden met specifieke bioactiviteiten. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen en bioassay om de aanwezigheid van cytolysinen te identificeren. De eerste stap omvat goedkope en eenvoudige technieken (geroerde en vries-dooicyclus) om cytolysines vrij te geven. We verkregen de hoogste cytolytische activiteit en eiwit (~ 500 mg eiwit uit 20 g droog gewicht). Vervolgens werd de polypeptidecomplexiteit van het extract geanalyseerd door SDS-PAGE-gel die eiwitten detecteerde met molecuulgewichten tussen 10 kDa en 250 kDa. In de hemolytische test gebruikten we schapenrode bloedcellen en bepaalden HU50 (11,1 ± 0,3 μg / ml). Daarentegen werd de aanwezigheid van fosfolipase in het ruwe extract bepaald met behulp van eigeel als substraat in een vast medium met agarose. Over het algemeen gebruikt deze studie een efficiënt en goedkoop protocol om het ruwe extract te bereiden en past repliceerbare bioassays toe om cytolysinen, moleculen met biotechnologische en biomedische belangen te identificeren.

Introduction

Zeedieren zijn een rijke bron van biologisch actieve verbindingen. In de afgelopen decennia heeft de samenstelling van zeeanemoongif wetenschappelijke aandacht getrokken, omdat het een diversiteit aan polypeptiden omvat met hemolytische, cytotoxische, enzymatische (fosfolipase, protease, chitinase) en neurotoxische activiteit en remmende effecten op proteolytische activiteit1. Bovendien zijn deze polypeptiden potentiële bronnen voor de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen in biotechnologisch en therapeutisch gebruik 2,3.

Er zijn weinig rapporten over zeeanemoongif en zijn moleculaire componenten vanwege de complexiteit van het verkrijgen van het gif, zelfs isolatie en karakterisering van toxines. De extractiemethoden die in de rapporten werden gebruikt, betroffen lysis en het legen van de inhoud van cellen die gerelateerd en niet gerelateerd zijn aan de gifproductie1.

Een bijzonder kenmerk in alle cnidarians is de afwezigheid van een systeem voor productie en afgifte van het gif gecentraliseerd in een enkel anatomisch gebied. In plaats daarvan zijn de nematocysten structuren die het gif 4,5 houden. Andere soorten cellen, epidermale kliercellen genaamd, scheiden ook toxines af en zijn ook verdeeld over het lichaam van zeeanemonen6.

De eerste en meest cruciale uitdaging bij het verkrijgen van het gif is het genereren van een extract met voldoende manipulatie in daaropvolgende processen, zonder de inactivatie of afbraak van labiele eiwitten. Vervolgens moeten de cellen worden gelyseerd en moeten de componenten – in dit geval polypeptiden – efficiënt en snel worden geëxtraheerd, waarbij proteolyse en hydrolyse worden vermeden terwijl andere cellulaire componenten wordengeëlimineerd 7.

Verschillende methoden worden gebruikt om het ruwe extract van een zeeanemoon te verkrijgen; sommige omvatten het opofferen van het organisme, terwijl anderen toestaan dat het in leven wordt gehouden. Methoden die het gebruik van het hele lichaam van het organisme impliceren, zorgen voor de afgifte van de meeste toxines uit het gif8, vergeleken met methoden die organismen in leven houden, die slechts enkele componenten van het gif9 extraheren. De bereiding van een extract vereist een evaluatie van de aanwezigheid en potentie van een stof van belang door middel van een specifieke bioassay, die strategieën omvat om de farmacologische effecten te observeren met behulp van in vivo of in vitro methoden10.

Zeeanemoongif bevat cytolytische polypeptiden, porievormende toxines (PFT’s)11 en fosfolipase12; deze moleculen zijn modellen in de studie van eiwit-lipide interactie, moleculaire hulpmiddelen in kankertherapie en biosensoren op basis van nanopore3. De classificatie van zeeanemoon PFT’s wordt uitgevoerd op basis van hun grootte of molecuulgewicht, van 5 kDa tot 80 kDa. De 20 kDa PFT, de meest bestudeerde en bekend als actinoporinen11, is van bijzonder belang vanwege zijn biomedische potentieel bij de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen voor mogelijke toepassingen als antikanker, antimicrobiële en op nanoporiën gebaseerde biosensoren. Een ander cytolysine, waaronder fosfolipase, met name fosfolipase A2 (PLA2)13, geeft een vetzuur af en hydrolyseert fosfolipiden, waardoor het celmembraan wordt gedestabiliseerd. Door dit werkingsmechanisme belooft PLA2 een essentieel model te zijn voor de studie en toepassingen bij ontstekingsziekten. Het zou kunnen dienen als een model voor studies van lipidengedrag in het celmembraan14.

Hier beschrijven we een efficiënt protocol voor het verkrijgen van het ruwe extract van zeeanemoon Anthopleura dowii Verrill, 1869, en het detecteren van hemolysines en fosfolipases. Beide zijn relevante toxines die kunnen worden gebruikt als een sjabloon om nieuwe moleculaire hulpmiddelen te ontwerpen.

Protocol

De zeeanemonen werden verzameld volgens de richtlijnen van de Nationale Commissie voor Aquacultuur, Visserij en Voedsel van de Federale Overheid van Mexico (vergunningsnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Bio-ethische commissie van het Instituut voor Biotechnologie, Nationale Autonome Universiteit van Mexico keurde alle experimenten met zeeanemonen goed. Het schapenbloedmonster werd gekocht bij het Center for Practical Teaching and Research in Animal Production and Health (CEPIPSA, National Autonomous University of Me…

Representative Results

De representatieve resultaten van het protocol dat werd gebruikt om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen, toonden aan dat het combineren van twee technieken (agitatie en cycli van invriezen en ontdooien) een efficiënte afvoer van nematocysten opleverde, en de totale hoeveelheid eiwit was 500 mg (8 mg / ml) (figuur 3). De eiwitcomplexiteit van het ruwe extract kon worden waargenomen vanaf 10 kDa en meer dan 250 kDa via SDS-PAGE-elektroforese. Daarnaast w…

Discussion

De grote vraag naar nieuwe verbindingen met toepassingen op verschillende gebieden van wetenschap en industrie heeft geleid tot de studie van gif. Gif vertegenwoordigt een rijke bron van moleculen die dient als een sjabloon voor het genereren van nieuwe moleculaire hulpmiddelen. De complexiteit van deze gifstoffen vereist echter de implementatie en combinatie van verschillende methoden om ze te verkrijgen en te bestuderen.

Hier tonen we een methode voor het verkrijgen en analyseren van het gif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), met een subsidienummer IT200819. De auteurs erkennen aan Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, voor het controleren van de Engelse grammatica van dit manuscript; en de technische bijstand van Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) en Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). We danken ook dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) voor het verkrijgen van schapenbloed. We bedanken in het bijzonder Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, voor de faciliteiten in zijn laboratorium voor de video-opname.

Materials

15 mL conical centrifuge tube Corning 430766
2-Bromophenol blue Sigma B75808
2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430828
Acetic Acid Glacial J.T. Baker 9515-03
Acrylamide Promega V3115
Agarose Promega V3125
Bisacrylamide Promega V3143
Bovine Serum Albumin Fraction V Sigma A3059-100G
Bradford Protein Assays Bio-Rad 5000006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C3306
Cell culture plates 96 well, V-bottom Corning 3894
Centrifuge Eppendorf 5804R
Centrifuge tubes Corning CLS430829
ChemiDoc MP system Bio-Rad 1708280
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
Clear flat.bottom 96-Well Plates Thermo Scientific 3855
Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio-Rad #1610406
Coomassie brilliant blue R-250 Bio-Rad 1610400
Dextrose J.T. Baker 1916-01
Ductless Enclosure Labconco Vertical https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ Bio Rad. Gel Documentation System
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-4L
Hemocytometer Marienfeld 650030
ImageJ (Software) NIH, USA Version 1.53c
Incubator 211 Labnet I5211 DS
Methanol J.T. Baker 9049-03
Mini-PROTEAN tetra cell Bio-Rad 1658000EDU
Na2HPO4 J.T. Baker 3824-01
NaCl J.T. Baker 3624-01
NaH2PO4.H2O J.T. Baker 3818-05
Origin software version 9 To design the plot with sigmoidal adjustments
Petridish Falcon 351007
Pipetman kit Gilson F167380
Precast mini gel BioRad 1658004
Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26620
Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 252433
SDS Sigma-Aldrich L4509
Sodium citrate dihydrate JT Baker 3646-01
Spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC G10S UV-VIS
Tris Base Sigma-Aldrich 77-86-1
Volt Power Supply Hoefer PS300B

References

  1. Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
  2. Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
  3. Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
  4. Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
  5. Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).
  6. Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
  7. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
  8. Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
  9. Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
  10. Hader, D., Erzinger, G. . Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).
  11. Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
  12. Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
  13. Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis – its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
  14. Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  17. Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
  18. Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
  19. Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
  20. de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
  21. Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
  22. Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
  23. Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
  24. Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
  25. Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
  26. Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).

Play Video

Cite This Article
Ramírez-Carreto, S., Salazar-García, S. I., Macías Martínez, G., Rodríguez-Almazán, C. Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays. J. Vis. Exp. (181), e63630, doi:10.3791/63630 (2022).

View Video