Идентификация гемолитической и фосфолипазной активности в сырых экстрактах из морских анемонов с помощью простых биоанализов
Summary
Здесь мы описываем протокол получения экстракта сырого яда из морского анемона и выявления его гемолитической и фосфолипазной активности.
Abstract
Состав яда морского анемона включает полипептидные и небелковые молекулы. Цитолитические компоненты обладают высоким биотехнологическим и биомедицинским потенциалом для разработки новых молекулярных инструментов. Яд морского анемона находится в железистых клетках эктодермы и субклеточных структур, называемых нематоцистами, оба из которых распределены по всему телу морского анемона. Эта характеристика подразумевает проблемы, потому что клетки и нематоцисты должны быть лизированы для высвобождения компонентов яда с другими нетоксичными молекулами. Поэтому сначала яд получают из сырого экстракта (смесь различных и разнообразных молекул и тканевого мусора). Следующим шагом является обнаружение полипептидов со специфической биологической активностью. Здесь мы описываем эффективную стратегию получения сырого экстракта морского анемона и биоанализа для выявления присутствия цитолизинов. Первый шаг включает в себя недорогие и простые методы (цикл перемешивания и замораживания-оттаивания) для высвобождения цитолизинов. Мы получили самую высокую цитолитическую активность и белок (~500 мг белка из 20 г сухого веса). Далее полипептидную сложность экстракта анализировали с помощью геля SDS-PAGE, детектирующего белки с молекулярной массой от 10 кДа до 250 кДа. В гемолитическом анализе мы использовали эритроциты овец и определяли HU50 (11,1 ± 0,3 мкг/мл). Напротив, наличие фосфолипаз в сыром экстракте определяли с помощью яичного желтка в качестве субстрата в твердой среде с агарозой. В целом, это исследование использует эффективный и недорогой протокол для приготовления сырого экстракта и применяет воспроизводимые биоанализы для идентификации цитолизинов, молекул с биотехнологическими и биомедицинскими интересами.
Introduction
Морские животные являются богатым источником биологически активных соединений. В последние десятилетия состав яда морского анемона привлек научное внимание, поскольку он включает в себя разнообразие полипептидов с гемолитической, цитотоксической, ферментативной (фосфолипаза, протеаза, хитиназа) и нейротоксической активностью и ингибирующим действием на протеолитическую активность1. Кроме того, эти полипептиды являются потенциальными источниками для разработки молекулярных инструментов в биотехнологическом и терапевтическом использовании 2,3.
Существует мало сообщений о яде морского анемона и его молекулярных компонентах из-за сложности получения яда, даже выделения и характеристики токсинов. Методы экстракции, используемые в отчетах, включали лизис и опорожнение содержимого клеток, которые связаны и не связаны с производством яда1.
Особой характеристикой у всех книдарианцев является отсутствие системы производства и высвобождения яда, централизованной в единой анатомической области. Вместо этого нематоцисты представляют собой структуры, которые удерживают яд 4,5. Другие типы клеток, называемые клетками эпидермальной железы, также выделяют токсины и также распределяются по всему телу морских анемонов6.
Первой и наиболее важной проблемой в получении яда является генерация экстракта с достаточными манипуляциями в последующих процессах, без инактивации или деградации лабильных белков. Далее клетки должны быть лизированы, а компоненты — в данном случае полипептиды — должны быть эффективно и быстро экстрагированы, избегая протеолиза и гидролиза при одновременном устранении других клеточных компонентов7.
Для получения сырого экстракта морского анемона используются различные методы; некоторые из них связаны с принесением в жертву организма, в то время как другие позволяют сохранить его живым. Методы, которые подразумевают использование всего тела организма, позволяют высвобождать большинство токсинов из яда8, по сравнению с методами, которые поддерживают жизнь организмов, которые извлекают только некоторые компоненты яда9. Приготовление экстракта требует оценки присутствия и эффективности вещества, представляющего интерес, посредством специфического биоанализа, который включает в себя стратегии наблюдения фармакологических эффектов методами in vivo или in vitro 10.
Яд морского анемона содержит цитолитические полипептиды, порообразующие токсины (ПФТ)11 и фосфолипазы12; эти молекулы являются моделями в изучении белково-липидного взаимодействия, молекулярными инструментами в терапии рака и биосенсорами на основе нанопор3. Классификация ФФТ морских анемонов проводится по их размерам или молекулярной массе, от 5 кДа до 80 кДа. PFT 20 кДа, наиболее изученный и известный как актинопорины11, представляет особый интерес из-за его биомедицинского потенциала в разработке молекулярных инструментов для возможных применений в качестве противоопухолевых, противомикробных и нанопоровых биосенсоров. Другой цитолизин, включая фосфолипазы, в частности фосфолипазу A2 (PLA2)13, высвобождает жирную кислоту и гидролизует фосфолипиды, дестабилизируя клеточную мембрану. Благодаря такому механизму действия PLA2 обещает стать важной моделью для изучения и применения при воспалительных заболеваниях. Он может служить моделью для исследований поведения липидов в клеточной мембране14.
Здесь мы описываем эффективный протокол получения сырого экстракта из морского анемона Anthopleura dowii Verrill, 1869, и обнаружения гемолизинов и фосфолипаз. Оба являются релевантными токсинами, которые могут быть использованы в качестве шаблона для разработки новых молекулярных инструментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Высокий спрос на новые соединения с применением в различных областях науки и промышленности привел к изучению яда. Яд представляет собой богатый источник молекул, который служит шаблоном для генерации новых молекулярных инструментов. Однако сложность этих ядов требует реализации и с?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Программой апойо проекта исследований и инноваций в области технологий (PAPIIT) с номером гранта IT200819. Авторы выражают признательность Тому Масселману, Rock Paper Editing, LLC, за проверку английской грамматики этой рукописи; и техническая помощь Саманты Хименес (СИСЕСЕ, Энсенада) и Хуана Мануэля Барбосы Кастильо (Институт физики Селулара, УНАМ). Мы также благодарим д-ра Аугусто Сезара Лизаразо Чапарро (CEPIPSA) за получение овечьей крови. Мы особенно благодарим д-ра Хосе Санигера Блесу, ICAT-UNAM, за оборудование в его лаборатории для видеозаписи.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
References
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
- Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
- Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
- Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).
- Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
- Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
- Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
- Hader, D., Erzinger, G. . Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).
- Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
- Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
- Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis – its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
- Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
- Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
- Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
- de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
- Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
- Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
- Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
- Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).
