זיהוי פעילות המוליטית ופוספוליפאזה בתמציות גולמיות מתוך שושנות ים על ידי מאמרים ביו-אסים פשוטים
Summary
כאן נתאר פרוטוקול להשגת תמצית ארס גולמית משכת ים וזיהוי פעילותה ההמוליטית והפוספוליפאזית.
Abstract
הרכב ארס שושנת הים כולל מולקולות פוליפפטידיות ולא חלבוניות. לרכיבים ציטוליטיים יש פוטנציאל ביו-טכנולוגי וביו-רפואי גבוה לתכנון כלים מולקולריים חדשים. ארס שושנת הים מאתר בתאים בלוטותיים מאקטודרם וממבנים תת-תאיים הנקראים נמטוציסטים, ששניהם מופצים בכל גוף שושנת הים. מאפיין זה מרמז על אתגרים מכיוון שיש למסתתר את התאים והנמטוציסטים כדי לשחרר את מרכיבי הארס עם מולקולות אחרות שאינן רעילות. לכן, ראשית, הארס מופק מתמצית גולמית (תערובת של מולקולות שונות ומגוונות ופסולת רקמות). השלב הבא הוא לזהות פוליפפטידים עם פעילות ביולוגית ספציפית. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להשגת תמצית גולמית של שושנת ים ובדיקה ביולוגית לזיהוי נוכחותם של ציטוליזינים. הצעד הראשון כולל טכניקות זולות ופשוטות (מחזור ערבוב והפשרה בהקפאה) לשחרור ציטוליסינים. השגנו את הפעילות הציטוטוליטית והחלבון הגבוהים ביותר (כ-500 מ”ג חלבון מ-20 גרם של משקל יבש). לאחר מכן, המורכבות הפוליפפטידית של התמצית נותחה על ידי ג’ל SDS-PAGE לאיתור חלבונים עם משקל מולקולרי בין 10 kDa ל-250 kDa. בבדיקה ההמוליטית השתמשנו בתאי דם אדומים של כבשים וקבענו HU50 (11.1 ± 0.3 מיקרוגרם/מ”ל). לעומת זאת, נוכחותם של פוספוליפאזות בתמצית הגולמית נקבעה באמצעות חלמון ביצה כמצע בתווך מוצק עם אגרוז. באופן כללי, מחקר זה משתמש בפרוטוקול יעיל וזול כדי להכין את התמצית הגולמית ומיישם בדיקות ביולוגיות הניתנות לשכפול כדי לזהות ציטוטוליזין, מולקולות בעלות תחומי עניין ביו-טכנולוגיים וביו-רפואיים.
Introduction
בעלי חיים ימיים הם מקור עשיר של תרכובות פעילות ביולוגית. בעשורים האחרונים, הרכב ארס שושנת הים משך תשומת לב מדעית מכיוון שהוא כולל מגוון של פוליפפטידים עם המוליטית, ציטוטוקסית, אנזימטית (פוספוליפאז, פרוטאז, צ’יטינאז), ופעילות נוירוטוקסית והשפעות מעכבות על פעילות פרוטאוליטית1. בנוסף, פוליפפטידים אלה הם מקורות פוטנציאליים לפיתוח כלים מולקולריים בשימוש ביו-טכנולוגי וטיפולי 2,3.
ישנם דיווחים מעטים על ארס שושנת ים ומרכיביו המולקולריים בשל המורכבות של קבלת הארס, אפילו בידוד ואפיון של רעלים. שיטות החילוץ ששימשו בדו”חות כללו תזה וריקון תוכן של תאים הקשורים ואינם קשורים לייצור הארס1.
מאפיין מסוים בכל הקנידריאנים הוא היעדר מערכת לייצור ושחרור של הארס המרוכז באזור אנטומי יחיד. במקום זאת, הנמטוציסטים הם מבנים ששומרים על הארס 4,5. סוגים אחרים של תאים, הנקראים תאי בלוטת האפידרמיס, מפרישים גם הם רעלים ומופצים גם הם בכל הגוף של שושנות הים6.
האתגר הראשון והמכריע ביותר בהשגת הארס הוא יצירת תמצית עם מניפולציה מספקת בתהליכים הבאים, ללא השתקה או פירוק של חלבונים מתכלים. לאחר מכן, התאים חייבים להיות lysed, ואת הרכיבים – במקרה זה, פוליפפטידים חייבים להיות מופקים ביעילות ובמהירות, הימנעות פרוטאוליזה הידרוליזה תוך ביטול רכיבים תאיים אחרים7.
שיטות שונות משמשות להשגת תמצית גולמית של שושנת ים; חלקם כרוכים בהקרבת האורגניזם בעוד שאחרים מאפשרים לו להישמר בחיים. שיטות המרמזות על שימוש בכל גופו של האורגניזם מאפשרות שחרור של רוב הרעלים מהארס8, בהשוואה לשיטות השומרות על אורגניזמים בחיים, אשר מוציאות רק כמה מרכיבים של הארס9. הכנת תמצית דורשת הערכת נוכחות ועוצמה של חומר בעל עניין באמצעות ביואסאי ספציפי, הכולל אסטרטגיות לבחון את ההשפעות הפרמקולוגיות על ידי שיטות in vivo או in vitro 10.
ארס שושנת ים מכיל פוליפפטידים ציטוטיים, רעלנים יוצרי נקבוביות (PFTs)11, ופוספוליפאזות12; מולקולות אלה הן מודלים בחקר האינטראקציה בין חלבונים לשומנים, כלים מולקולריים בטיפול בסרטן וביוסנסורים המבוססים על ננו-נקבוביות3. הסיווג של שושנת ים PFTs מתבצע על פי גודלם או משקלם המולקולרי, מ 5 kDa עד 80 kDa. ה-20 kDa PFT, הנחקר והידוע ביותר כאקטינופורינים11, מעניין במיוחד את הפוטנציאל הביו-רפואי שלו בפיתוח כלים מולקולריים ליישומים אפשריים כביו-סנסורים אנטי-סרטניים, אנטי-מיקרוביאליים ומבוססי ננו-נקבוביות. ציטוליסין נוסף, כולל פוספוליפאזות, במיוחד פוספוליפאז A2 (PLA2)13, משחרר חומצת שומן עקב הידרוליזה פוספוליפידים, ומערער את יציבות קרום התא. בשל מנגנון פעולה זה, PLA2 מבטיח להיות מודל חיוני למחקר ויישומים במחלות דלקתיות. הוא יכול לשמש מודל למחקרים על התנהגות השומנים בקרום התא14.
כאן אנו מתארים פרוטוקול יעיל להשגת התמצית הגסה משכנת הים Anthopleura dowii Verrill, 1869, ולזיהוי המוליסינים ופוספוליפאזות. שניהם רעלנים רלוונטיים שיכולים לשמש כתבנית לתכנון כלים מולקולריים חדשים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הביקוש הגבוה לתרכובות חדשות עם יישומים בתחומים שונים של מדע ותעשייה הוביל לחקר הארס. ארס מייצג מקור עשיר של מולקולות המשמש כתבנית ליצירת כלים מולקולריים חדשים. עם זאת, המורכבות של ארסים אלה דורשת יישום ושילוב של שיטות שונות כדי להשיג וללמוד אותם.
כאן, אנו מראים שיטה להשגת ונ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), עם מספר מענק IT200819. המחברים מודים לטום מוסלמן, עריכת נייר רוק, LLC, על בדיקת הדקדוק האנגלי של כתב יד זה; והסיוע הטכני של סמנטה חימנס (CICESE, אנסנדה) וחואן מנואל ברבוסה קסטילו (המכון לפיסולי, UNAM). אנו מודים גם לד”ר אוגוסטו סזאר ליזאראזו צ’פארו (CEPIPSA) על השגת דם כבשים. אנו מודים במיוחד לד”ר חוסה סניגר בלזה, ICAT-UNAM, על המתקנים במעבדה שלו להקלטת הווידאו.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
References
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
- Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
- Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
- Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).
- Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
- Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
- Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
- Hader, D., Erzinger, G. . Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).
- Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
- Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
- Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis – its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
- Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
- Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
- Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
- de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
- Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
- Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
- Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
- Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).
