Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.
Glaucoom, wereldwijd de op één na belangrijkste oorzaak van blindheid, is een heterogene groep oogaandoeningen die wordt gekenmerkt door structurele schade aan de oogzenuw en degeneratie van retinale ganglioncellen (RGC), wat resulteert in visuele disfunctie door de overdracht van visuele informatie van het oog naar de hersenen te onderbreken. Verhoogde intraoculaire druk is de belangrijkste risicofactor; Daarom zijn er verschillende modellen van oculaire hypertensie ontwikkeld bij knaagdieren door genetische of experimentele benaderingen om de oorzaken en gevolgen van de ziekte te onderzoeken. Daarvan zijn enkele beperkingen gemeld, zoals chirurgische invasiviteit, ontoereikende functionele beoordeling, vereiste van uitgebreide training en zeer variabele uitbreiding van netvliesschade. Het huidige werk kenmerkt een eenvoudige, goedkope en efficiënte methode om oculaire hypertensie bij knaagdieren te induceren, gebaseerd op cauterisatie bij lage temperatuur en volledige cirkel van de limbale vasculaire plexus, een belangrijk onderdeel van de drainage van kamerwater. Het nieuwe model biedt een technisch gemakkelijke, niet-invasieve en reproduceerbare subacute oculaire hypertensie, geassocieerd met progressieve RGC en degeneratie van de oogzenuw, en een uniek postoperatief klinisch herstelpercentage dat in vivo functionele studies mogelijk maakt door zowel elektrofysiologische als gedragsmethoden.
In de medische literatuur wordt glaucoom opgevat als een heterogene groep optische neuropathieën die wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van retinale ganglioncellen (RGC’s), dendrieten, soma en axonen, resulterend in structurele cupping (uitgraving) van de optische schijf en functionele verslechtering van de oogzenuw, wat leidt tot amaurosis in ongecontroleerde gevallen door de overdracht van visuele informatie van het oog naarde hersenen te onderbreken 1. Glaucoom is momenteel wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van onomkeerbare blindheid en zal naar verwachting in 2040 ongeveer 111,8 miljoen mensen bereiken2, waardoor de kwaliteit van leven van patiënten ernstig wordt aangetast en aanzienlijke sociaaleconomische problemen ontstaan3.
Verhoogde intraoculaire druk (IOD) is een van de belangrijkste en de enige aanpasbare risicofactoren voor de ontwikkeling en progressie van glaucoom. Van de vele soorten glaucoom zijn ze allemaal, behalve normaal spanningsglaucoom (NTG), geassocieerd met verhoogde IOP op enig moment in de klinische geschiedenis van de ziekte. Ondanks opmerkelijke klinische en chirurgische vooruitgang om IOD aan te pakken en de ziekteprogressie te vertragen of te stoppen, verliezen patiënten nog steeds het gezichtsvermogen als gevolg van glaucoom 4,5. Daarom is een grondig begrip van de complexe en multifactoriële pathofysiologie van deze ziekte noodzakelijk voor de ontwikkeling van effectievere behandelingen, met name om neuroprotectie te bieden aan RGC’s.
Van een verscheidenheid aan experimentele benaderingen voor het begrijpen van ziektemechanismen, lijken diermodellen op basis van oculaire hypertensie (OHT) het meest op humaan glaucoom. Knaagdiermodellen zijn bijzonder nuttig omdat ze goedkoop zijn, gemakkelijk te hanteren zijn, genetisch kunnen worden gemanipuleerd, een korte levensduur hebben en oculaire anatomische en fysiologische kenmerken vertonen die vergelijkbaar zijn met die van mensen, zoals de productie en drainage van kamerwater 6,7,8,9,10,11,12,13 . Momenteel gebruikte modellen zijn onder meer sclerose van het trabeculaire netwerk na injectie van hypertone zoutoplossing in episclerale aderen 14, intracamerale injectie van microbeads 15 of visco-elastische stoffen 16, cauterisatie van vortexaders 17, fotocoagulatie van het trabeculaire netwerk met argonlaser 18, circumlimbale hechting 19 en gebruik van een transgeen model van leeftijdsgebonden OHT (DBA/2J-muizen)8. Invasiviteit, postoperatieve troebeling van het hoornvlies, verstoring van het voorste segment, uitgebreide leercurves, dure apparatuur en zeer variabele postoperatieve IOP’s behoren echter tot enkele van de gerapporteerde valkuilen die verband houden met de huidige modellen, waardoor de ontwikkeling van een alternatief model van OHT een eis is om deze problemen te overwinnen20,21,22.
Het huidige protocol formaliseert een nieuwe chirurgische ingreep om OHT te induceren als een proxy voor glaucoom, gebaseerd op limbale plexus cauterisatie (LPC) bij knaagdieren23. Dit is een eenvoudig, reproduceerbaar, toegankelijk en niet-invasief model dat een hoge efficiëntie en lage variabiliteit van IOD-verhoging biedt, geassocieerd met een uniek hoog percentage volledig klinisch herstel, waardoor in vivo functionele evaluatie wordt geboden bij een verminderd aantal dieren dat in elk experiment wordt gebruikt. De chirurgische techniek induceert subacute OHT met een geleidelijke terugkeer naar de basislijnniveaus in een paar dagen, wat de hypertensieve aanval modelleert die wordt gezien bij acuut geslotenhoekglaucoom. Bovendien wordt het IOD-herstel in het model gevolgd door continue glaucoomneurodegeneratie, wat nuttig is voor toekomstige mechanistische studies van de secundaire degeneratie van RGC’s, die optreedt in verschillende gevallen van humaan glaucoom ondanks adequate controle van IOD.
Limbale plexus cauterisatie (LPC) is een nieuw post-trabeculair model met het voordeel dat het zich richt op gemakkelijk toegankelijke vasculaire structuren waarvoor geen conjunctivale of pendissectie nodig is17,28. Anders dan het cauterisatiemodel van vortexaders, een gerenommeerd OHT-model gebaseerd op de chirurgische stoornis van choroïde veneuze drainage, wordt niet verwacht dat veneuze congestie de IOD-stijging in het LPC-model zal beïnvloeden, aangezien l…
The authors have nothing to disclose.
We erkennen onze laboranten José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza en Luciano Cavalcante Ferreira. Dit onderzoek werd gefinancierd door FAPERJ, CNPq en CAPES.
Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | – | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
EPON Resin | Polysciences, Inc. | – | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
LSM 510 Meta | Carl Zeiss | – | Confocal epifluorescence microscope |
Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | – | System for electroretinogram recording |
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | – | Software for electroretinogram signal processing |
Optomotry | CerebralMechanics | – | System for optomotor response analysis |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
Carl Zeiss | – | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |