Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores
Summary
El objetivo de este protocolo es caracterizar un nuevo modelo de neurodegeneración glaucomatosa basado en la cauterización térmica de 360° del plexo vascular limbal, induciendo hipertensión ocular subaguda.
Abstract
El glaucoma, la segunda causa de ceguera en todo el mundo, es un grupo heterogéneo de trastornos oculares caracterizados por daño estructural en el nervio óptico y la degeneración de las células ganglionares de la retina (RGC), lo que resulta en una disfunción visual al interrumpir la transmisión de información visual del ojo al cerebro. La presión intraocular elevada es el factor de riesgo más importante; Por lo tanto, se han desarrollado varios modelos de hipertensión ocular en roedores mediante enfoques genéticos o experimentales para investigar las causas y los efectos de la enfermedad. Entre ellas, se han descrito algunas limitaciones, como la invasividad quirúrgica, la evaluación funcional inadecuada, la necesidad de un entrenamiento extenso y la extensión muy variable del daño retiniano. El presente trabajo caracteriza un método simple, de bajo costo y eficiente para inducir hipertensión ocular en roedores, basado en la cauterización a baja temperatura y de círculo completo del plexo vascular limbal, un componente importante del drenaje acuoso del humor. El nuevo modelo proporciona una hipertensión ocular subaguda técnicamente fácil, no invasiva y reproducible, asociada a RGC progresiva y degeneración del nervio óptico, y una tasa de recuperación clínica postoperatoria única que permite estudios funcionales in vivo por métodos electrofisiológicos y conductuales.
Introduction
La literatura médica entiende el glaucoma como un grupo heterogéneo de neuropatías ópticas caracterizadas por la degeneración progresiva de las células ganglionares de la retina (CGR), dendritas, soma y axones, lo que resulta en ahuecamiento estructural (excavación) del disco óptico y deterioro funcional del nervio óptico, lo que conduce a amaurosis en casos no controlados al interrumpir la transmisión de información visual desde el ojo al cerebro1. El glaucoma es actualmente la causa más común de ceguera irreversible en todo el mundo, y se prevé que llegue a aproximadamente 111,8 millones de personas en 20402, lo que afectará profundamente la calidad de vida (CV) de los pacientes y generará importantes problemas socioeconómicos3.
La presión intraocular (PIO) elevada es uno de los factores de riesgo más importantes y el único modificable para el desarrollo y progresión del glaucoma. Entre los múltiples tipos de glaucoma, todos, excepto el glaucoma de tensión normal (NTG), se asocian con una PIO elevada en algún momento de la historia clínica de la enfermedad. A pesar de los notables avances clínicos y quirúrgicos para atacar la PIO y ralentizar o detener la progresión de la enfermedad, los pacientes siguen perdiendo la visión debido al glaucoma 4,5. Por lo tanto, un conocimiento profundo de la fisiopatología compleja y multifactorial de esta enfermedad es imperativo para el desarrollo de tratamientos más efectivos, especialmente para proporcionar neuroprotección a los CGR.
Entre una variedad de enfoques experimentales para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad, los modelos animales basados en la hipertensión ocular (OHT) se parecen más al glaucoma humano. Los modelos de roedores son particularmente útiles ya que son de bajo costo, son fáciles de manejar, pueden ser manipulados genéticamente, tienen una vida útil corta y presentan características anatómicas y fisiológicas oculares comparables a las humanas, como la producción de humor acuoso y el drenaje 6,7,8,9,10,11,12,13 . Los modelos utilizados actualmente incluyen la esclerosis de la malla trabecular después de la inyección de solución salina hipertónica en las venas epiesclerales 14, la inyección intracameral de microperlas 15 o sustancias viscoelásticas 16, la cauterización de las venas del vórtice 17, la fotocoagulación de la malla trabecular con láser de argón 18, la sutura circumlimbal 19 y el uso de un modelo transgénico de OHT relacionado con la edad (ratones DBA/2J)8. Sin embargo, la invasividad, la opacificación postoperatoria de la córnea, la disrupción del segmento anterior, las extensas curvas de aprendizaje, el costoso equipamiento y las PIO postoperatorias altamente variables, son algunos de los escollos reportados asociados a los modelos actuales, lo que hace que el desarrollo de un modelo alternativo de THO sea una demanda para superar estos problemas20,21,22.
El presente protocolo formaliza un novedoso procedimiento quirúrgico para inducir THO como proxy del glaucoma, basado en la cauterización del plexo limbal (LPC) en roedores23. Se trata de un modelo fácil, reproducible, accesible y no invasivo que proporciona una alta eficiencia y una baja variabilidad de la elevación de la PIO, asociada a una tasa excepcionalmente alta de recuperación clínica completa, por lo que proporciona una evaluación funcional in vivo en un número reducido de animales utilizados en cada experimento. La técnica quirúrgica induce la OHT subaguda con un retorno gradual a los niveles basales en pocos días, lo que modela el ataque hipertensivo observado en el glaucoma agudo de ángulo cerrado. Además, la recuperación de la PIO en el modelo va seguida de una neurodegeneración glaucomatosa continua, lo que es útil para futuros estudios mecanicistas de la degeneración secundaria de las CGR, que se produce en varios casos de glaucoma humano a pesar de un control adecuado de la PIO.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cauterización del plexo limbal (LPC) es un nuevo modelo posttrabecular con la ventaja de que se dirige a estructuras vasculares de fácil acceso que no requieren disección conjuntival o de tenas17,28. A diferencia del modelo de cauterización de las venas de vórtice, un modelo de OHT de renombre basado en el deterioro quirúrgico del drenaje venoso coroideo, no se espera que la congestión venosa influya en el aumento de la PIO en el modelo LPC, ya que las …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a nuestros técnicos de laboratorio José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza y Luciano Cavalcante Ferreira. Esta investigación fue financiada por la FAPERJ, el CNPq y la CAPES.
Materials
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | – | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | – | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | – | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | – | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | – | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | – | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | – | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
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