Summary

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Published: February 15, 2022
doi:

Summary

Bu protokolün amacı, subakut oküler hipertansiyonu indükleyen limbal vasküler pleksusun 360° termik koterizasyonuna dayanan yeni bir glokomatöz nörodejenerasyon modelini karakterize etmektir.

Abstract

Dünya çapında körlüğün ikinci önde gelen nedeni olan glokom, optik sinirde yapısal hasar ve retina ganglion hücresi (RGC) dejenerasyonu ile karakterize, gözden beyne görsel bilgi iletimini kesintiye uğratarak görsel işlev bozukluğuna neden olan heterojen bir oküler bozukluk grubudur. Göz içi basıncının yükselmesi en önemli risk faktörüdür; Bu nedenle, hastalığın nedenlerini ve etkilerini araştırmak için genetik veya deneysel yaklaşımlarla kemirgenlerde çeşitli oküler hipertansiyon modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında cerrahi invazivlik, yetersiz fonksiyonel değerlendirme, kapsamlı eğitim gereksinimi ve retina hasarının oldukça değişken uzantısı gibi bazı sınırlamalar bildirilmiştir. Bu çalışma, sulu mizah drenajının önemli bir bileşeni olan limbal vasküler pleksusun düşük sıcaklıkta, tam daire koterizasyonuna dayalı olarak kemirgenlerde oküler hipertansiyonu indüklemek için basit, düşük maliyetli ve etkili bir yöntemi karakterize etmektedir. Yeni model, ilerleyici RGC ve optik sinir dejenerasyonu ile ilişkili, teknik olarak kolay, noninvaziv ve tekrarlanabilir bir subakut oküler hipertansiyon ve hem elektrofizyolojik hem de davranışsal yöntemlerle in vivo fonksiyonel çalışmalara izin veren benzersiz bir postoperatif klinik iyileşme oranı sağlar.

Introduction

Tıp literatürü glokomu, retinal ganglion hücrelerinin (RGC’ler), dendritlerin, soma ve aksonların ilerleyici dejenerasyonu ile karakterize heterojen bir optik nöropati grubu olarak anlamaktadır, bu da optik diskin yapısal çukurluğu (kazısı) ve optik sinirin fonksiyonel bozulması ile sonuçlanan, kontrolsüz vakalarda gözden beyne görsel bilgi iletimini kesintiye uğratarak amaurozise yol açmaktadır1. Glokom şu anda dünya çapında geri dönüşü olmayan körlüğün en yaygın nedenidir ve 2040 yılında yaklaşık 111,8 milyon kişiye ulaşacağı tahmin edilmektedir2, bu nedenle hastaların yaşam kalitesini (YK) derinden etkilemekte ve önemli sosyoekonomik kaygılara yol açmaktadır3.

Yüksek göz içi basıncı (GİB), glokomun gelişimi ve ilerlemesi için en önemli ve değiştirilebilir tek risk faktörlerinden biridir. Birden fazla glokom tipi arasında, normal tansiyonlu glokom (NTG) hariç tümü, hastalığın klinik öyküsünde bir süre yüksek GİB ile ilişkilidir. GİB’yi hedeflemek ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak veya durdurmak için kayda değer klinik ve cerrahi gelişmelere rağmen, hastalar glokom nedeniyle hala görme yetisini kaybetmektedir 4,5. Bu nedenle, bu hastalığın karmaşık ve multifaktöriyel patofizyolojisinin tam olarak anlaşılması, özellikle RGC’lere nöroproteksiyon sağlamak için daha etkili tedavilerin geliştirilmesi için zorunludur.

Hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına yönelik çeşitli deneysel yaklaşımlar arasında, oküler hipertansiyona (OHT) dayalı hayvan modelleri en çok insan glokomuna benzemektedir. Kemirgen modelleri, düşük maliyetli oldukları, kullanımı kolay oldukları, genetik olarak manipüle edilebildikleri, kısa ömürlü oldukları ve sulu mizah üretimi ve drenajı gibi insanlarla karşılaştırılabilir oküler anatomik ve fizyolojik özellikler sundukları için özellikle kullanışlıdır 6,7,8,9,10,11,12,13 . Şu anda kullanılan modeller arasında episkleral venlere 14 hipertonik salin enjeksiyonunu takiben trabeküler ağın sklerozu, mikroboncukların 15 veya viskoelastik maddelerin16 intrakameral enjeksiyonu, vorteks damarlarınınkoterizasyonu 17, trabeküler ağın argon lazer 18 ile fotokoagülasyonu, circumlimbal sütür 19 ve yaşa bağlı OHT’nin transgenik bir modelinin (DBA/2J fareler) kullanımı yer almaktadır8. Bununla birlikte, invazivlik, korneanın postoperatif opaklaşması, ön segment bozulması, kapsamlı öğrenme eğrileri, pahalı ekipman ve oldukça değişken postoperatif GİB’ler, mevcut modellerle ilişkili bildirilen tuzaklardan birkaçı arasındadır ve bu sorunların üstesinden gelmek için alternatif bir OHT modelinin geliştirilmesini talep etmektedir20,21,22.

Mevcut protokol, kemirgenlerde limbal pleksus koterizasyonuna (LPC) dayalı olarak glokoma vekil olarak OHT’yi indüklemek için yeni bir cerrahi prosedürü resmileştirmektedir23. Bu, benzersiz bir şekilde yüksek bir tam klinik iyileşme oranı ile ilişkili, yüksek verimlilik ve düşük GİB yükselmesi değişkenliği sağlayan, dolayısıyla her deneyde kullanılan daha az sayıda hayvanda in vivo fonksiyonel değerlendirme sağlayan kolay, tekrarlanabilir, erişilebilir ve invaziv olmayan bir modeldir. Cerrahi teknik, akut açı kapanması glokomunda görülen hipertansif atağı modelleyen, birkaç gün içinde başlangıç seviyelerine kademeli bir dönüş ile subakut OHT’yi indükler. Ayrıca, modeldeki GİB iyileşmesini, GİB’nin yeterli kontrolüne rağmen birkaç insan glokomu vakasında meydana gelen RGC’lerin sekonder dejenerasyonunun gelecekteki mekanik çalışmaları için yararlı olan sürekli glokomatöz nörodejenerasyon takip eder.

Protocol

Tüm prosedürler, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği’nin (ARVO) Oftalmik ve Görsel Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildiri’ye uygun olarak gerçekleştirildi ve Rio de Janeiro Federal Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi’nden Bilimsel Deneylerde Hayvanların Kullanımına İlişkin Etik Komite tarafından onaylandı (protokol 083/17). Bu çalışmada, her iki cinsiyetten 2-3 aylık ve 180-320 g ağırlığındaki Lister Hooded sıçanlar kullanıldı. Bununla birlikte, prosedü…

Representative Results

Kantitatif değişkenler ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edilir. OHT ve kontrol grupları arasındaki GİB dinamiklerinin karşılaştırılması dışında (Şekil 1F), istatistiksel analiz iki yönlü ANOVA ve ardından Sidak’ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapıldı. p değerinin 0.05< olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Şekil 1 , limbal damarların 360° termal kaynakl…

Discussion

Limbal pleksus koterizasyonu (LPC), konjonktival veya zıvana diseksiyonu gerektirmeyen, kolay erişilebilir vasküler yapıları hedefleme avantajına sahip yeni bir trabeküler modeldir17,28. Koroid venöz drenajın cerrahi bozukluğuna dayanan ünlü bir OHT modeli olan vorteks venler koterizasyon modelinden farklı olarak, limbal venler sulu mizah çıkışında yukarı akışta yer aldığından, venöz tıkanıklığın LPC modelinde GİB artışını etkil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Laboratuvar teknisyenlerimiz José’ye; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza ve Luciano Cavalcante Ferreira. Bu araştırma FAPERJ, CNPq ve CAPES tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Acetone Isofar 201 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography Hansol Medical Co Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon Novartis Biociências S/A MS-1.0068.1087 Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride Vetec 560 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx Bovie Medical Corporation AA00 Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin Syntec do Brasil Ltda 000200-3-000003 Ketamine hydrochloride 10%
DAKO Dako North America S3023 Antifade mounting medium
DAPI Thermo Fisher Scientific 28718-90-3 diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0487 Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin Polysciences, Inc. Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16110 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-8042140002 Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab Icare Finland Oy TV02 (model number) Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A31570 Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches Samsung Electronics Co. Ltd. S23B550 Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta Carl Zeiss Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0489 Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K Nihon Kohden Corporation System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a MilliporeSigma MAB-1585 Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33 Nihon Kohden Corporation Software for electroretinogram signal processing
Optomotry CerebralMechanics System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19100 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide Electron Microscopy Sciences 20150 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography Chalgren Enterprises 110-63 Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 12300 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-1.0497.1287 Prednisolone acetate 0.12%
Terolac Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0497.1286 Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina Laboratórios Pfizer Ltda MS-1.0216.0024 Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL Reichert Technologies 230635 Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3 Thermo Fisher Scientific T3605 Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 Non-ionic surfactant
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin Syntec do Brasil Ltda 7899 Xylazine hydrochloride 2%
Carl Zeiss Stereo microscope for surgery and retinal dissection

References

  1. Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
  4. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  5. Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
  6. Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
  7. Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
  8. John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
  9. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
  10. Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
  11. vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
  12. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
  13. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
  14. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  15. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  16. Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
  17. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
  18. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
  19. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  20. Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
  21. Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
  22. Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
  23. Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
  24. vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
  25. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  26. Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
  27. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
  28. Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
  29. Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , 139-157 (2008).
  30. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).

Play Video

Cite This Article
Lani-Louzada, R., Abreu, C. A., Araújo, V. G., Dias, M. S., Petrs-Silva, H., Linden, R. Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. (180), e63442, doi:10.3791/63442 (2022).

View Video