Bu protokolün amacı, subakut oküler hipertansiyonu indükleyen limbal vasküler pleksusun 360° termik koterizasyonuna dayanan yeni bir glokomatöz nörodejenerasyon modelini karakterize etmektir.
Dünya çapında körlüğün ikinci önde gelen nedeni olan glokom, optik sinirde yapısal hasar ve retina ganglion hücresi (RGC) dejenerasyonu ile karakterize, gözden beyne görsel bilgi iletimini kesintiye uğratarak görsel işlev bozukluğuna neden olan heterojen bir oküler bozukluk grubudur. Göz içi basıncının yükselmesi en önemli risk faktörüdür; Bu nedenle, hastalığın nedenlerini ve etkilerini araştırmak için genetik veya deneysel yaklaşımlarla kemirgenlerde çeşitli oküler hipertansiyon modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında cerrahi invazivlik, yetersiz fonksiyonel değerlendirme, kapsamlı eğitim gereksinimi ve retina hasarının oldukça değişken uzantısı gibi bazı sınırlamalar bildirilmiştir. Bu çalışma, sulu mizah drenajının önemli bir bileşeni olan limbal vasküler pleksusun düşük sıcaklıkta, tam daire koterizasyonuna dayalı olarak kemirgenlerde oküler hipertansiyonu indüklemek için basit, düşük maliyetli ve etkili bir yöntemi karakterize etmektedir. Yeni model, ilerleyici RGC ve optik sinir dejenerasyonu ile ilişkili, teknik olarak kolay, noninvaziv ve tekrarlanabilir bir subakut oküler hipertansiyon ve hem elektrofizyolojik hem de davranışsal yöntemlerle in vivo fonksiyonel çalışmalara izin veren benzersiz bir postoperatif klinik iyileşme oranı sağlar.
Tıp literatürü glokomu, retinal ganglion hücrelerinin (RGC’ler), dendritlerin, soma ve aksonların ilerleyici dejenerasyonu ile karakterize heterojen bir optik nöropati grubu olarak anlamaktadır, bu da optik diskin yapısal çukurluğu (kazısı) ve optik sinirin fonksiyonel bozulması ile sonuçlanan, kontrolsüz vakalarda gözden beyne görsel bilgi iletimini kesintiye uğratarak amaurozise yol açmaktadır1. Glokom şu anda dünya çapında geri dönüşü olmayan körlüğün en yaygın nedenidir ve 2040 yılında yaklaşık 111,8 milyon kişiye ulaşacağı tahmin edilmektedir2, bu nedenle hastaların yaşam kalitesini (YK) derinden etkilemekte ve önemli sosyoekonomik kaygılara yol açmaktadır3.
Yüksek göz içi basıncı (GİB), glokomun gelişimi ve ilerlemesi için en önemli ve değiştirilebilir tek risk faktörlerinden biridir. Birden fazla glokom tipi arasında, normal tansiyonlu glokom (NTG) hariç tümü, hastalığın klinik öyküsünde bir süre yüksek GİB ile ilişkilidir. GİB’yi hedeflemek ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak veya durdurmak için kayda değer klinik ve cerrahi gelişmelere rağmen, hastalar glokom nedeniyle hala görme yetisini kaybetmektedir 4,5. Bu nedenle, bu hastalığın karmaşık ve multifaktöriyel patofizyolojisinin tam olarak anlaşılması, özellikle RGC’lere nöroproteksiyon sağlamak için daha etkili tedavilerin geliştirilmesi için zorunludur.
Hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına yönelik çeşitli deneysel yaklaşımlar arasında, oküler hipertansiyona (OHT) dayalı hayvan modelleri en çok insan glokomuna benzemektedir. Kemirgen modelleri, düşük maliyetli oldukları, kullanımı kolay oldukları, genetik olarak manipüle edilebildikleri, kısa ömürlü oldukları ve sulu mizah üretimi ve drenajı gibi insanlarla karşılaştırılabilir oküler anatomik ve fizyolojik özellikler sundukları için özellikle kullanışlıdır 6,7,8,9,10,11,12,13 . Şu anda kullanılan modeller arasında episkleral venlere 14 hipertonik salin enjeksiyonunu takiben trabeküler ağın sklerozu, mikroboncukların 15 veya viskoelastik maddelerin16 intrakameral enjeksiyonu, vorteks damarlarınınkoterizasyonu 17, trabeküler ağın argon lazer 18 ile fotokoagülasyonu, circumlimbal sütür 19 ve yaşa bağlı OHT’nin transgenik bir modelinin (DBA/2J fareler) kullanımı yer almaktadır8. Bununla birlikte, invazivlik, korneanın postoperatif opaklaşması, ön segment bozulması, kapsamlı öğrenme eğrileri, pahalı ekipman ve oldukça değişken postoperatif GİB’ler, mevcut modellerle ilişkili bildirilen tuzaklardan birkaçı arasındadır ve bu sorunların üstesinden gelmek için alternatif bir OHT modelinin geliştirilmesini talep etmektedir20,21,22.
Mevcut protokol, kemirgenlerde limbal pleksus koterizasyonuna (LPC) dayalı olarak glokoma vekil olarak OHT’yi indüklemek için yeni bir cerrahi prosedürü resmileştirmektedir23. Bu, benzersiz bir şekilde yüksek bir tam klinik iyileşme oranı ile ilişkili, yüksek verimlilik ve düşük GİB yükselmesi değişkenliği sağlayan, dolayısıyla her deneyde kullanılan daha az sayıda hayvanda in vivo fonksiyonel değerlendirme sağlayan kolay, tekrarlanabilir, erişilebilir ve invaziv olmayan bir modeldir. Cerrahi teknik, akut açı kapanması glokomunda görülen hipertansif atağı modelleyen, birkaç gün içinde başlangıç seviyelerine kademeli bir dönüş ile subakut OHT’yi indükler. Ayrıca, modeldeki GİB iyileşmesini, GİB’nin yeterli kontrolüne rağmen birkaç insan glokomu vakasında meydana gelen RGC’lerin sekonder dejenerasyonunun gelecekteki mekanik çalışmaları için yararlı olan sürekli glokomatöz nörodejenerasyon takip eder.
Limbal pleksus koterizasyonu (LPC), konjonktival veya zıvana diseksiyonu gerektirmeyen, kolay erişilebilir vasküler yapıları hedefleme avantajına sahip yeni bir trabeküler modeldir17,28. Koroid venöz drenajın cerrahi bozukluğuna dayanan ünlü bir OHT modeli olan vorteks venler koterizasyon modelinden farklı olarak, limbal venler sulu mizah çıkışında yukarı akışta yer aldığından, venöz tıkanıklığın LPC modelinde GİB artışını etkil…
The authors have nothing to disclose.
Laboratuvar teknisyenlerimiz José’ye; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza ve Luciano Cavalcante Ferreira. Bu araştırma FAPERJ, CNPq ve CAPES tarafından finanse edilmiştir.
Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | – | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
EPON Resin | Polysciences, Inc. | – | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
LSM 510 Meta | Carl Zeiss | – | Confocal epifluorescence microscope |
Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | – | System for electroretinogram recording |
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | – | Software for electroretinogram signal processing |
Optomotry | CerebralMechanics | – | System for optomotor response analysis |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
Carl Zeiss | – | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |