Cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs
Summary
L’objectif de ce protocole est de caractériser un nouveau modèle de neurodégénérescence glaucomateuse basé sur une cautérisation thermique à 360° du plexus vasculaire limbique, induisant une hypertension oculaire subaiguë.
Abstract
Le glaucome, deuxième cause de cécité dans le monde, est un groupe hétérogène de troubles oculaires caractérisés par des lésions structurelles du nerf optique et une dégénérescence des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), entraînant un dysfonctionnement visuel en interrompant la transmission des informations visuelles de l’œil au cerveau. Une pression intraoculaire élevée est le facteur de risque le plus important ; Ainsi, plusieurs modèles d’hypertension oculaire ont été développés chez les rongeurs par des approches génétiques ou expérimentales pour étudier les causes et les effets de la maladie. Parmi celles-ci, certaines limites ont été signalées, telles que l’invasivité chirurgicale, l’évaluation fonctionnelle inadéquate, la nécessité d’une formation approfondie et l’extension très variable des lésions rétiniennes. Le présent travail caractérise une méthode simple, peu coûteuse et efficace pour induire l’hypertension oculaire chez les rongeurs, basée sur la cautérisation à basse température et en cercle complet du plexus vasculaire limbique, une composante majeure du drainage de l’humeur aqueuse. Le nouveau modèle fournit une hypertension oculaire subaiguë techniquement facile, non invasive et reproductible, associée à un CGR progressif et à une dégénérescence du nerf optique, ainsi qu’un taux de récupération clinique postopératoire unique qui permet des études fonctionnelles in vivo par des méthodes électrophysiologiques et comportementales.
Introduction
La littérature médicale considère le glaucome comme un groupe hétérogène de neuropathies optiques caractérisées par une dégénérescence progressive des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), des dendrites, du soma et des axones, entraînant une ventouse structurelle (excavation) du disque optique et une détérioration fonctionnelle du nerf optique, conduisant à l’amaurose dans les cas non contrôlés en interrompant la transmission des informations visuelles de l’œil au cerveau1. Le glaucome est actuellement la cause la plus fréquente de cécité irréversible dans le monde, et devrait toucher environ 111,8 millions de personnes en 20402, affectant ainsi profondément la qualité de vie des patients et entraînant d’importantes préoccupations socio-économiques3.
L’élévation de la pression intraoculaire (PIO) est l’un des facteurs de risque les plus importants et les seuls modifiables pour le développement et la progression du glaucome. Parmi les multiples types de glaucome, tous, à l’exception du glaucome à tension normale (NTG), sont associés à une PIO élevée à un moment donné de l’histoire clinique de la maladie. Malgré des avancées cliniques et chirurgicales remarquables pour cibler la PIO et ralentir ou arrêter la progression de la maladie, les patients perdent toujours la vue en raison du glaucome 4,5. Par conséquent, une compréhension approfondie de la physiopathologie complexe et multifactorielle de cette maladie est impérative pour le développement de traitements plus efficaces, en particulier pour fournir une neuroprotection aux CGR.
Parmi une variété d’approches expérimentales pour la compréhension des mécanismes de la maladie, les modèles animaux basés sur l’hypertension oculaire (OHT) ressemblent le plus au glaucome humain. Les modèles de rongeurs sont particulièrement utiles car ils sont peu coûteux, faciles à manipuler, peuvent être manipulés génétiquement, ont une courte durée de vie et présentent des caractéristiques anatomiques et physiologiques oculaires comparables à celles des humains, telles que la production et le drainage de l’humeur aqueuse 6,7,8,9,10,11,12,13 . Les modèles actuellement utilisés comprennent la sclérose du réseau trabéculaire après injection de solution saline hypertonique dans les veines épisclérales14, l’injection intracamérale de microbilles15 ou de substances viscoélastiques 16, la cautérisation des veines vortex 17, la photocoagulation du réseau trabéculaire avec un laser argon 18, la suture circumlimbique 19 et l’utilisation d’un modèle transgénique d’OHT liée à l’âge (souris DBA/2J)8. Cependant, le caractère invasif, l’opacification postopératoire de la cornée, la perturbation du segment antérieur, les courbes d’apprentissage étendues, l’équipement coûteux et les PIO postopératoires très variables sont quelques-uns des pièges signalés associés aux modèles actuels, ce qui fait du développement d’un modèle alternatif d’OHT une exigence pour surmonter ces problèmes20,21,22.
Le présent protocole formalise une nouvelle intervention chirurgicale pour induire l’OHT en tant qu’indicateur du glaucome, basée sur la cautérisation du plexus limbique (LPC) chez les rongeurs23. Il s’agit d’un modèle simple, reproductible, accessible et non invasif qui offre une grande efficacité et une faible variabilité de l’élévation de la PIO, associée à un taux particulièrement élevé de récupération clinique complète, permettant ainsi une évaluation fonctionnelle in vivo chez un nombre réduit d’animaux utilisés dans chaque expérience. La technique chirurgicale induit une HTO subaiguë avec un retour progressif aux niveaux de base en quelques jours, ce qui modélise l’attaque hypertensive observée dans le glaucome aigu à angle fermé. De plus, la récupération de la PIO dans le modèle est suivie d’une neurodégénérescence glaucomateuse continue, ce qui est utile pour les futures études mécanistiques de la dégénérescence secondaire des CGR, qui se produit dans plusieurs cas de glaucome humain malgré un contrôle adéquat de la PIO.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cautérisation du plexus limbique (LPC) est un nouveau modèle post-trabéculaire qui présente l’avantage de cibler des structures vasculaires facilement accessibles ne nécessitant pas de dissection conjonctivale ou à tenon17,28. Contrairement au modèle de cautérisation des veines vortex, un modèle d’OHT renommé basé sur l’atteinte chirurgicale du drainage veineux choroïde, la congestion veineuse ne devrait pas influencer l’augmentation de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions nos techniciens de laboratoire José ; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza et Luciano Cavalcante Ferreira. Cette recherche a été financée par la FAPERJ, le CNPq et le CAPES.
Materials
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | – | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | – | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | – | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | – | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | – | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | – | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | – | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
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