Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

Um grande número de eventos de motilidade dentro das células eucarióticas são mediados pela função das proteínas motoras moleculares. Esses motores se movem ao longo dos filamentos citoesqueléticos, filamentos de actin e microtúbulos (MTs), e convertem a energia química da hidrólise ATP em forças cinéticas e mecânicas necessárias para conduzir a motilidade biológica dentro das células. O S. cerevisiae Cin8, baseado em MT, é uma proteína motora bipolar, homotetrameric quinase-5 que cruza e desliza MTs de eixo¹. O Cin8 executa funções essenciais durante a mitose, na montagem do eixo ^2,3,4 e no alongamento do eixo durante a anafase ^5,6,7. Anteriormente, havia sido demonstrado que o Cin8 é um motor bidirecional, que muda a direcionalidade em diferentes condições experimentais. Por exemplo, sob altas condições de resistência iônica, motores Cin8 únicos movem-se em direção à extremidade inferior dos MTs, enquanto em clusters, em ensaios de deslizamento MT multimotores, e entre MTs antiparalhais, os motores Cin8 movem-se principalmente em direção às extremidades mais altas dos MTs 8,9,10,11,12 . Esses achados foram altamente inesperados por várias razões. Primeiro, o Cin8 carrega seu domínio motor catalítico no amino-terminus e tais motores foram previamente acreditados como exclusivamente mais-end dirigidos, enquanto Cin8 foi mostrado ser menos-fim direcionado ao nível de molécula única. Em segundo lugar, acreditava-se que os motores de cinesina eram unidirecionais, seja de ponta ou de ponta, enquanto o Cin8 mostrou-se bi-direcional, dependendo das condições experimentais. Finalmente, por causa da orientação em MT no fuso mitótico, o papel clássico dos motores cinesina-5 na separação de postes de fuso durante a montagem do fuso e da anfífase B só poderia ser explicado por sua motilidade direcionada plus-end nos MTs que eles cruzam ^1,13. Após os primeiros relatos sobre a bidirecionalidade do Cin8, alguns outros motores de cinesina foram demonstrados como bi-direcionais 14,15,16, indicando que a motilidade bidirecional dos motores de cinesina pode ser mais comum do que se acreditava anteriormente.

Foi relatado anteriormente que nas células, o Cin8 também se move de forma bidirecional⁸, apoiando a noção de que a motilidade bidirecional de alguns motores cinesin-5 é importante para suas funções intracelulares. Além disso, uma vez que os três motores cinesin-5 que foram relatados como bidirecionais são de células fúngicas, um possível papel para a bidalidade bi-direcionalidade dos motores cinesin-5 foi recentemente proposto nessas células¹⁰. De acordo com este modelo, em mitose fechada de células fúngicas, onde o envelope nuclear não quebra durante a mitose, os motores de quinase-5 fornecem a força inicial que separa os polos do eixo antes da montagem do eixo. Para realizar esta tarefa, antes da separação do polo de fuso, os motores kinesin-5 localizam-se perto dos polos de fuso, por sua motilidade direcionada sem fim em MTs nucleares únicos. Uma vez nesta posição, os motores kinesin-5 agrupam, alternam direcionalidade, capturam e cruzam MTs de postes de fuso vizinhos. Posteriormente, os motores kinesin-5 fornecem a separação inicial dos polos por motilidade dirigida plus-end nos MTs que eles cruzam. Por este modelo, tanto a motilidade dirigida por fim em MTs único quanto a motilidade direcionada plus-end em MTs transversais durante o deslizamento antiparal são necessárias para que os motores fúngicos kinesin-5 realizem seus papéis na montagem^{do eixo 1,13}.

O objetivo geral do método descrito é obter kinesina-5 Cin8 marcada por FFP de alta pureza e realizar ensaios de motilidade de molécula única (Figura 1) enquanto analisa separadamente a motilidade de moléculas únicas e aglomerados de Cin8. A separação entre moléculas únicas e aglomerados é importante, uma vez que um dos fatores que foram demonstrados para afetar a direcionalidade do Cin8 é o seu acúmulo em clusters nos MTs^10,12. Ensaios alternativos de motilidade, como o deslizamento de superfície mt e ensaios deslizantes de MT não fornecem informações sobre a atividade de proteínas motoras únicas ^17,18. Os robustos métodos de ensaio e análise de motilidade de molécula única descritos aqui foram aplicados com sucesso para caracterizar diferentes aspectos dos motores kinesin-5, Cin8 e Kip1 10,11,12,14,19,20.

Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para a superexpressão e purificação do Cin8, polimerização de MTs e o ensaio de motilidade de molécula única. Além disso, também são descritas as análises para diferenciar moléculas e aglomerados únicos de Cin8 e determinar velocidades motoras e cluster únicas por deslocamento médio (MD) e análise média de deslocamento quadrado (MSD). Este protocolo tem como objetivo ajudar os pesquisadores a visualizar todas as etapas dos procedimentos e auxiliar na solução de problemas desse tipo de ensaio.

Figura 1: Representação esquemática do ensaio de motilidade de molécula única. Os MTs fluorescentes biotinilados são anexados à superfície de vidro, revestidos com o Avidin que interage com o biotinilado-BSA conectado à superfície. O arqueiro verde representa a direção de movimento de moléculas cin8 únicas sob altas condições de resistência iônica. +/- representar a polaridade do MT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.