حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae
Summary
يتراكم الكينيسين-5 Cin8 الانقسامي ثنائي الاتجاه في مجموعات تنقسم وتندمج أثناء حركتها. التراكم في مجموعات يغير أيضا سرعة واتجاه Cin8. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاختبارات الحركة مع Cin8-GFP المنقى وتحليل الخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8.
Abstract
تؤدي محركات كينيسين -5 ثنائية القطب الانقسامية وظائف أساسية في ديناميكيات المغزل. تظهر هذه المحركات بنية متجانسة رباعية مع زوجين من مجالات المحركات الحفازة ، وتقع في طرفي نقيض من المجمع النشط. تمكن هذه البنية الفريدة محركات kinesin-5 من الربط والانزلاق بعيدا عن الأنابيب الدقيقة المغزل المضادة للتوازي (MTs) ، وبالتالي توفير القوة الموجهة ظاهريا التي تفصل بين قطبي المغزل عن بعضهما البعض. في السابق ، كان يعتقد أن محركات kinesin-5 موجهة حصريا بالإضافة إلى النهاية. ومع ذلك ، كشفت الدراسات الحديثة أن العديد من محركات كينيسين 5 الفطرية موجهة ناقص النهاية على مستوى الجزيء الواحد ويمكنها تغيير الاتجاه في ظل ظروف تجريبية مختلفة. يعد Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 مثالا على هذا البروتين الحركي ثنائي الاتجاه: في ظروف القوة الأيونية العالية ، تتحرك جزيئات واحدة من Cin8 في اتجاه نهاية MTs ناقص. وتبين أيضا أن Cin8 تشكل مجموعات متحركة، في الغالب في الطرف الناقص من MTs، ويسمح هذا التجمع ل Cin8 بتبديل الاتجاه والخضوع لحركية بطيئة زائدة موجهة. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لجميع خطوات العمل مع kinesin-5 Cin8 الموسوم ب GFP ، من الإفراط في التعبير عن البروتين في خلايا S. cerevisiae وتنقيته إلى فحص حركية جزيء واحد في المختبر . تساعد الطريقة المطورة حديثا الموصوفة هنا على التمييز بين الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 ، بناء على شدة التألق. تتيح هذه الطريقة تحليلا منفصلا لحركية الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 ، مما يوفر توصيف اعتماد حركية Cin8 على حجم عنقودها.
Introduction
يتم توسط عدد كبير من أحداث الحركة داخل الخلايا حقيقية النواة من خلال وظيفة البروتينات الحركية الجزيئية. تتحرك هذه المحركات على طول خيوط الهيكل الخلوي ، وخيوط الأكتين ، والأنابيب الدقيقة (MTs) ، وتحول الطاقة الكيميائية للتحلل المائي ATP إلى قوى حركية وميكانيكية مطلوبة لدفع الحركة البيولوجية داخل الخلايا. S. cerevisiae Cin8 القائم على MT هو بروتين محرك كينيسين -5 ثنائي القطب ، متجانس ، يربط ويمرر MTs المغزل بعيداعن 1. يؤدي Cin8 وظائف أساسية أثناء الانقسام ، في تجميع المغزل2،3،4 واستطالة المغزل خلال الطور5،6،7. في السابق ، ثبت أن Cin8 هو محرك ثنائي الاتجاه ، يقوم بتبديل الاتجاه في ظل ظروف تجريبية مختلفة. على سبيل المثال ، في ظل ظروف القوة الأيونية العالية ، تتحرك محركات Cin8 المفردة نحو الطرف السفلي من MTs ، بينما في المجموعات ، في اختبارات MT المنزلقة متعددة المحركات ، وبين MTs المضادة للتوازي ، تتحرك محركات Cin8 بشكل أساسي نحو النهايات الإضافية ل MTs 8,9,10,11,12 . كانت هذه النتائج غير متوقعة للغاية لعدة أسباب. أولا ، يحمل Cin8 مجال محركه الحفاز عند المحطة الأمينية وكان يعتقد سابقا أن هذه المحركات موجهة حصريا بالإضافة إلى النهاية ، في حين تبين أن Cin8 موجهة إلى نهاية ناقصة على مستوى الجزيء الواحد. ثانيا، كان يعتقد أن محركات كينيسين أحادية الاتجاه، إما ناقصة النهاية أو زائدة التوجيه، في حين تبين أن Cin8 ثنائي الاتجاه، اعتمادا على الظروف التجريبية. أخيرا ، بسبب اتجاه MT في المغزل الانقسامي ، لا يمكن تفسير الدور الكلاسيكي لمحركات kinesin-5 في فصل أقطاب المغزل أثناء تجميع المغزل و anaphase B إلا من خلال حركتها الموجهة ذات النهاية الإضافية على MTs التي تتقاطع معها 1,13. بعد التقارير الأولى عن ثنائية الاتجاه ل Cin8 ، ثبت أن بعض محركات كينيسين الأخرى ثنائية الاتجاه14،15،16 ، مما يشير إلى أن الحركة ثنائية الاتجاه لمحركات كينيسين قد تكون أكثر شيوعا مما كان يعتقد سابقا.
وقد أفيد سابقا أنه في الخلايا ، يتحرك Cin8 أيضا بطريقة ثنائية الاتجاه8 ، مما يدعم فكرة أن الحركة ثنائية الاتجاه لبعض محركات kinesin-5 مهمة لوظائفها داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن محركات kinesin-5 الثلاثة التي تم الإبلاغ عنها على أنها ثنائية الاتجاه هي من خلايا فطرية ، فقد تم مؤخرا اقتراح دور محتمل لمحركات kinesin-5 ثنائية الاتجاه في هذه الخلايا10. وفقا لهذا النموذج ، في الانقسام المغلق للخلايا الفطرية ، حيث لا ينهار المغلف النووي أثناء الانقسام ، توفر محركات kinesin-5 القوة الأولية التي تفصل قطبي المغزل قبل تجميع المغزل. لأداء هذه المهمة ، قبل فصل قطب المغزل ، تتمركز محركات kinesin-5 بالقرب من أقطاب المغزل ، من خلال حركتها الموجهة ذات النهاية الناقصة على MTs نووية واحدة. بمجرد الوصول إلى هذا الموضع ، تتجمع محركات kinesin-5 ، وتحول الاتجاه ، وتلتقط ، وتتقاطع مع MTs من أقطاب المغزل المجاورة. في وقت لاحق ، توفر محركات kinesin-5 الفصل الأولي للأقطاب عن طريق الحركة الموجهة زائد النهاية على MTs التي تتقاطع معها. من خلال هذا النموذج، يلزم وجود حركية موجهة ناقصة النهاية على MTs مفردة وحركية موجهة زائد النهاية على MTs متقاطعة أثناء الانزلاق المضاد للتوازي لمحركات kinesin-5 الفطرية لأداء أدوارها في تجميع المغزل 1,13.
الهدف العام من الطريقة الموصوفة هو الحصول على كينيسين الفطرية عالية النقاء الموسومة ب GFP-5 Cin8 وإجراء اختبارات حركية جزيء واحد (الشكل 1) مع تحليل حركية الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 بشكل منفصل. الفصل بين الجزيئات المفردة والعناقيد مهم لأن أحد العوامل التي ثبت أنها تؤثر على اتجاه Cin8 هو تراكمه في مجموعات على MTs10,12. لا توفر مقايسات الحركة البديلة ، مثل انزلاق سطح MT ومقايسات انزلاق MT معلومات تتعلق بنشاط البروتينات ذات المحرك الواحد17,18. تم تطبيق طرق فحص وتحليل حركية الجزيء الواحد القوية الموصوفة هنا بنجاح لتوصيف جوانب مختلفة من محركات كينيسين-5 ، Cin8 و Kip1 10،11،12،14،19،20.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للإفراط في التعبير والتنقية Cin8 ، وبلمرة MTs ، وفحص حركية الجزيء الواحد. وعلاوة على ذلك، فإن التحليلات الرامية إلى التمييز بين الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8، وتحديد السرعات الحركية والعنقودية المفردة عن طريق تحليل متوسط الإزاحة (MD) ومتوسط الإزاحة المربعة (MSD). يهدف هذا البروتوكول إلى مساعدة الباحثين على تصور جميع خطوات الإجراءات والمساعدة في استكشاف أخطاء هذا النوع من المقايسات وإصلاحها.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لفحص حركية الجزيء الواحد. يتم توصيل MTs الفلورسنت البيوتينيل بالسطح الزجاجي ، المطلي ب Avidin الذي يتفاعل مع البيوتينيل BSA المرتبط بالسطح. يمثل السهم الأخضر اتجاه حركة جزيئات Cin8 المفردة في ظل ظروف القوة الأيونية العالية. +/- تمثل قطبية MT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل ، يتم تقديم بروتوكول لفحص حركية جزيء واحد مع kinesin-5 Cin8 ثنائي الاتجاه وتحليل الحركة. تم تنقية Cin818 كامل الطول بما في ذلك إشارة التوطين النووي الأصلية (NLS) في المحطة C من المضيف الأصلي S. cerevisiae. نظرا لأن Cin8 هو بروتين محرك نووي ، فقد وجد أن طحن خلايا S. cerevisiae تحت الن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال منحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF-386/18) ومنحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية ثنائية القومية (BSF-2019008) ، الممنوحة ل L.G.
Materials
| Adenine | FORMEDIUM | DOC0230 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | Sigma | A8549 | |
| Casein | Sigma | C7078 | |
| Catalase (C40) | Sigma | C40 | |
| Creatine-Kinase | Sigma | C3755 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fluorescence filter set for GFP | Chroma | 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2) | |
| Fluorescence filter set for Rhodamine | Chroma | 49004: ET-CY3/TRITC | |
| Fluorescence inverted microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| Galactose | Tivan Biotech | GAL02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glucose Oxidase | Sigma | G7141 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GlycylGlycine | Merck | G0674 | |
| GMPCPP | Jana Bioscience | Nu-405L | |
| GTB | Cytoskeleton | BST01-010 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| Histidine | Duchefa Biochemie | H0710.0100 | |
| ImageJ-FIJI software | https://imagej.net/plugins/trackmate/ | version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10 | |
| Imidazole | Sigma | I0125 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Abcam | ab119211 | |
| Lens | Zeiss | 100x/1.4 oil DIC objective | |
| Lysine | FORMEDIUM | DOC0161 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| Methionine | Duchefa Biochemie | M0715.0100 | |
| Neo | Andor Technologies | sCMOS camera | |
| NeutraAvidin | Life | A2666 | |
| Ni-NTA Agarose | Invitrogen | R901-15 | |
| Phospho-Creatine | Sigma | P1937 | |
| Pipes | Sigma | P1851 | |
| Pluronic acid F-127 (poloxamer) | Sigma | P2443 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Raffinose | Tivan Biotech | RAF01 | |
| Size Exclusion chromatography instument | GE Healthcare | AKTA Pure | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop | |
| Superose-6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris | Roshe | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tryptophan | Duchefa Biochemie | T0720.0100 | |
| Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin, biotinylated | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin, TRITC Rhodamine | Cytoskeleton | TL530M | |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | |
| Yeast nitrogen base | FORMEDIUM | CYN0401S | |
| α-GFP antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC8036 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
References
- Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
- Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
- Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
- Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
- Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
- Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
- Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
- Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
- Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
- Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
- Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
- Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
- Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
- Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
- Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
- Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
- Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
- Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
- Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
- Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
- Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
- Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).
