Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

Un gran número de eventos de motilidad dentro de las células eucariotas están mediados por la función de las proteínas motoras moleculares. Estos motores se mueven a lo largo de los filamentos citoesqueléticos, filamentos de actina y microtúbulos (TM), y convierten la energía química de la hidrólisis de ATP en fuerzas cinéticas y mecánicas necesarias para impulsar la motilidad biológica dentro de las células. La S. cerevisiae Cin8 basada en MT es una proteína motora bipolar homotetramérica de quinesina-5 que se entrelaza y desliza las MT del huso¹. Cin8 realiza funciones esenciales durante la mitosis, en el ensamblaje del huso ^2,3,4 y el alargamiento del huso durante la anafase ^5,6,7. Anteriormente, se había demostrado que Cin8 es un motor bidireccional, que cambia la direccionalidad bajo diferentes condiciones experimentales. Por ejemplo, en condiciones de alta resistencia iónica, los motores Cin8 individuales se mueven hacia el extremo inferior de los MT, mientras que en los grupos, en los ensayos de deslizamiento MT multimotor y entre los MT antiparalelos, los motores Cin8 se mueven principalmente hacia los extremos superiores de los MT 8,9,10,11,12 . Estos hallazgos fueron altamente inesperados debido a varias razones. En primer lugar, Cin8 lleva su dominio motor catalítico en el extremo amino y anteriormente se creía que tales motores estaban dirigidos exclusivamente al extremo más, mientras que se demostró que el Cin8 estaba dirigido al extremo inferior dirigido al nivel de una sola molécula. En segundo lugar, se creía que los motores de kinesina eran unidireccionales, ya sea de extremo inferior o de extremo más, mientras que se demostró que Cin8 era bidireccional, dependiendo de las condiciones experimentales. Finalmente, debido a la orientación MT en el huso mitótico, el papel clásico de los motores de kinesina-5 en la separación de los polos del husillo durante el ensamblaje del husillo y la anafase B solo podría explicarse por su motilidad dirigida de extremo superior en los MT que se entrecruzan ^1,13. Después de los primeros informes sobre la bidireccionalidad de Cin8, se demostró que algunos otros motores de kinesina son bidireccionales 14,15,16, lo que indica que la motilidad bidireccional de los motores de quinesina puede ser más común de lo que se creía anteriormente.

Se ha informado previamente que en las células, Cin8 también se mueve de manera bidireccional⁸, apoyando la noción de que la motilidad bidireccional de algunos motores de quinesina-5 es importante para sus funciones intracelulares. Además, dado que los tres motores de quinesina-5 que se informó que eran bidireccionales son de células fúngicas, recientemente se ha propuesto un posible papel para la bidireccionalidad de los motores de quinesina-5 en tales células¹⁰. Según este modelo, en la mitosis cerrada de las células fúngicas, donde la envoltura nuclear no se descompone durante la mitosis, los motores de kinesina-5 proporcionan la fuerza inicial que separa los polos del huso antes del ensamblaje del huso. Para realizar esta tarea, antes de la separación de los polos del husillo, los motores de kinesina-5 se localizan cerca de los polos del husillo, por su motilidad dirigida de extremo negativo en MT nucleares individuales. Una vez en esta posición, los motores de kinesina-5 se agrupan, cambian la direccionalidad, capturan y entrecruzan los MT de los polos del husillo vecinos. Posteriormente, los motores de kinesina-5 proporcionan la separación inicial de los polos por motilidad dirigida de extremo más en los MT que se entrecruzan. Según este modelo, tanto la motilidad dirigida de extremo inferior en MT individuales como la motilidad dirigida de extremo más en MT reticuladas durante el deslizamiento antiparalelo son necesarias para que los motores de kinesina-5 fúngica desempeñen sus funciones en el ensamblaje del husillo ^1,13.

El objetivo general del método descrito es obtener cin8 fúngico de alta pureza marcado con GFP Cin8 y realizar ensayos de motilidad de molécula única (Figura 1) mientras se analiza por separado la motilidad de moléculas individuales y grupos de Cin8. La separación entre moléculas individuales y clusters es importante ya que uno de los factores que se ha demostrado que afectan a la direccionalidad de Cin8 es su acumulación en clusters en los MTs^10,12. Los ensayos de motilidad alternativos, como los ensayos de deslizamiento de superficie MT y deslizamiento MT no proporcionan información sobre la actividad de proteínas motoras individuales^17,18. Los robustos métodos de ensayo y análisis de motilidad de una sola molécula descritos aquí se han aplicado con éxito para caracterizar diferentes aspectos de los motores de kinesina-5, Cin8 y Kip1 10,11,12,14,19,20.

Aquí, se presenta un protocolo detallado para la sobreexpresión y purificación de Cin8, la polimerización de MT y el ensayo de motilidad de molécula única. Además, también se describen los análisis para diferenciar entre moléculas individuales y grupos de Cin8, y para determinar las velocidades de un solo motor y de clúster mediante el análisis de desplazamiento medio (DM) y desplazamiento cuadrado medio (MSD). Este protocolo tiene como objetivo ayudar a los investigadores a visualizar todos los pasos de los procedimientos y ayudar con la solución de problemas de este tipo de ensayos.

Figura 1: Representación esquemática del ensayo de motilidad de una sola molécula. Los MT fluorescentes biotinilados se unen a la superficie del vidrio, recubiertos con Avidin que interactúa con el BSA biotinilado a la superficie. La flecha verde representa la dirección de movimiento de moléculas individuales de Cin8 en condiciones de alta resistencia iónica. +/- representa la polaridad de la MT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.