Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules de S. cerevisiae

Un grand nombre d’événements de motilité dans les cellules eucaryotes sont médiés par la fonction des protéines motrices moléculaires. Ces moteurs se déplacent le long des filaments cytosquelettiques, des filaments d’actine et des microtubules (MT), et convertissent l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP en forces cinétiques et mécaniques nécessaires pour conduire la motilité biologique dans les cellules. Le S. cerevisiae Cin8 à base de MT est une protéine motrice bipolaire homotétramérique de la kinésine-5 qui réticule et sépare les MT du fuseau¹. Cin8 remplit des fonctions essentielles pendant la mitose, dans l’assemblage de la broche ^2,3,4 et l’allongement de la broche pendant l’anaphase ^5,6,7. Auparavant, il avait été démontré que Cin8 est un moteur bidirectionnel, qui commute la directionnalité dans différentes conditions expérimentales. Par exemple, dans des conditions de résistance ionique élevée, les moteurs Cin8 simples se déplacent vers l’extrémité inférieure des MT, tandis que dans les clusters, dans les essais de glissement MT multimoteurs et entre les MT antiparallèles, les moteurs Cin8 se déplacent principalement vers les extrémités plus des MT 8,9,10,11,12 . Ces résultats étaient très inattendus pour plusieurs raisons. Tout d’abord, Cin8 porte son domaine moteur catalytique à l’amino-terminus et de tels moteurs étaient auparavant considérés comme exclusivement dirigés vers l’extrémité plus, tandis que Cin8 s’est avéré être dirigé vers l’extrémité moins au niveau de la molécule unique. Deuxièmement, on croyait que les moteurs à kinésine étaient unidirectionnels, soit dirigés vers l’extrémité moins, soit vers l’extrémité plus, tandis que Cin8 s’est avéré bidirectionnel, selon les conditions expérimentales. Enfin, en raison de l’orientation MT au niveau de la broche mitotique, le rôle classique des moteurs kinésine-5 dans la séparation des pôles de broche lors de l’assemblage de la broche et de l’anaphase B ne pouvait s’expliquer que par leur motilité dirigée plus-end sur les MT qu’ils réticulent ^1,13. À la suite des premiers rapports sur la bidirectionnalité de Cin8, il a été démontré que quelques autres moteurs de kinésine étaient bidirectionnels 14,15,16, ce qui indique que la motilité bidirectionnelle des moteurs de kinésine pourrait être plus courante qu’on ne le croyait auparavant.

Il a déjà été rapporté que dans les cellules, Cin8 se déplace également de manière bidirectionnelle⁸, soutenant l’idée que la motilité bidirectionnelle de certains moteurs kinésine-5 est importante pour leurs fonctions intracellulaires. De plus, étant donné que les trois moteurs à kinésine-5 qui ont été signalés comme étant bidirectionnels proviennent de cellules fongiques, un rôle possible pour la bidirectionnalité des moteurs à la kinésine-5 a récemment été proposé dans ces cellules¹⁰. Selon ce modèle, dans la mitose fermée des cellules fongiques, où l’enveloppe nucléaire ne se décompose pas pendant la mitose, les moteurs kinésine-5 fournissent la force initiale qui sépare les pôles de la broche avant l’assemblage de la broche. Pour effectuer cette tâche, avant la séparation des pôles de la broche, les moteurs à kinésine 5 se localisent près des pôles de la broche, par leur motilité dirigée à l’extrémité négative sur les MT nucléaires simples. Une fois à cette position, les moteurs kinésine-5 se regroupent, commutent la directionnalité, capturent et réticulent les MT des pôles de broche voisins. Par la suite, les moteurs kinésine-5 assurent la séparation initiale des pôles par motilité dirigée plus-end sur les MT qu’ils réticulent. Selon ce modèle, la motilité dirigée à l’extrémité moins sur les MT simples et la motilité dirigée à extrémité plus sur les MT réticulés lors du glissement antiparallèle sont nécessaires pour que les moteurs à kinésine 5 fongique remplissent leur rôle dans l’assemblage de la broche ^1,13.

L’objectif global de la méthode décrite est d’obtenir de la kinésine-5 Cin8 fongique de haute pureté marquée GFP et d’effectuer des tests de motilité à molécule unique (Figure 1) tout en analysant séparément la motilité de molécules uniques et de grappes de Cin8. La séparation entre les molécules individuelles et les amas est importante car l’un des facteurs dont il a été démontré qu’il affectait la directionnalité de Cin8 est son accumulation en grappes sur les MT^10,12. Les essais de motilité alternatifs, tels que les essais de glissement de surface MT et les essais de glissement MT, ne fournissent pas d’informations concernant l’activité des protéines motrices uniques^17,18. Les méthodes robustes de dosage et d’analyse de la motilité à molécule unique décrites ici ont été appliquées avec succès pour caractériser différents aspects des moteurs kinésine-5, Cin8 et Kip1 10,11,12,14,19,20.

Ici, un protocole détaillé est présenté pour la surexpression et la purification de Cin8, la polymérisation des MT et le test de motilité à molécule unique. En outre, les analyses visant à différencier les molécules uniques et les amas de Cin8 et à déterminer les vitesses des moteurs et des grappes par l’analyse du déplacement moyen (MD) et du déplacement carré moyen (MSD) sont également décrites. Ce protocole vise à aider les chercheurs à visualiser toutes les étapes des procédures et à faciliter le dépannage de ce type de tests.

Figure 1 : Représentation schématique du test de motilité à molécule unique. Les MT fluorescents biotinylés sont fixés à la surface du verre, recouverts d’avidine qui interagit avec le BSA biotinylé attaché à la surface. La flèche verte représente la direction du mouvement des molécules uniques de Cin8 dans des conditions de force ionique élevée. +/- représentent la polarité du MT. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.