יישום אקטואלי Bioassay כדי לכמת רעילות קוטל חרקים עבור יתושים וזבובי פירות
Summary
אנו מתארים את המתודולוגיה והחשיבות של היישום האקטואלי bioassay למדידת רגישות לקוטלי חרקים אצל יתושים וזבובי פירות. הבדיקה המוצגת היא בעלת תפוקה גבוהה, משתמשת במסת חרקים – ובכך מאפשרת לחשב מינון קטלני בעל יחסות מסה במקום ריכוז – וסביר להניח שיש לה שונות נמוכה יותר משיטות דומות אחרות.
Abstract
המשך השימוש בקוטלי חרקים לבריאות הציבור ולחקלאות הוביל לעמידות נרחבת לקוטלי חרקים ולפגיעה בשיטות ההדברה. מעקב אחר עמידות לקוטלי חרקים אחר אוכלוסיות יתושים נעשה בדרך כלל באמצעות בדיקות ביולוגיות של בקבוקים של המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) או בדיקות צינור של ארגון הבריאות העולמי (WHO). עם זאת, שיטות אלה יכולות לגרום לרמה גבוהה של שונות בנתוני התמותה עקב מגע משתנה של קוטל חרקים עם החרק, מספר קטן יחסית של אורגניזמים שנבדקו, שונות נרחבת במסה בין אוכלוסיות ותנאי סביבה משתנים ללא הרף, מה שמוביל לתוצאות משתנות. מאמר זה מציג את היישום האקטואלי bioassay, המותאם כמאמר ביו-אסאיפי פנוטיפי בעל תפוקה גבוהה הן עבור יתושים והן עבור זבובי פירות, כדי לבחון מספר רב של חרקים לאורך מגוון של ריכוזי קוטל חרקים.
בדיקה זו 1) מבטיחה טיפול עקבי ומגע עם קוטל חרקים עם כל אורגניזם, 2) מייצרת עקומות מינון-תגובה ספציפיות ביותר המביאות בחשבון את ההבדלים במסה הממוצעת בין זנים ומינים (החשובה במיוחד עבור אורגניזמים שנאספו בשדה), ו-3) מאפשרת חישוב של מינונים קטלניים חציוניים קפדניים סטטיסטית (LD50 ), אשר נחוצים להשוואות יחס התנגדות – גישת מעקב חלופית מתמותה מינון אבחוני, המשמשת גם למעקב אחר עמידות בפני זחלים. בדיקה זו תהיה כלי משלים לפנוטיפ מדויק של אוכלוסיות יתושים, וכפי שהודגם באמצעות זבובי פירות, היא ניתנת להתאמה בקלות לשימוש עם חרקים אחרים. אנו טוענים כי בדיקה זו תסייע למלא את הפער בין עמידות גנוטיפית לקוטלי חרקים פנוטיפיים במספר מיני חרקים.
Introduction
יתושים אחראים ליותר מ-700,000 מקרי מוות מדי שנה כתוצאה מהמחלות שהם מעבירים לבני אדם, כאשר יותר ממחצית ממקרי המוות הללו נובעים ממלריה בלבד1. שיטת המניעה העיקרית נגד העברת מלריה ומחלות אחרות המועברות על ידי וקטורים היא השימוש בקוטלי חרקים, לעתים קרובות בצורה של רשתות קוטל חרקים ארוכות טווח או ריסוס שיוריפנימי 2. עם זאת, עמידות לקוטלי חרקים נפוצה בקרב יתושים וווקטורים אחרים של חרקים, כמו גם מזיקים חקלאיים 3,4. כדי לנהל ביעילות את ההתנגדות, המעקב הוא בעל חשיבות מרכזית5. לשם כך, יש צורך בשיטות זיהוי עמידות מדויקות מאוד ובתפוקה גבוהה. נכון לעכשיו, כלי המעקב הנפוצים ביותר אחר עמידות לקוטלי חרקים עבור יתושים הם בדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי6 ובקבוק ה- CDC bioassay7. עבור זבובי פירות שיטת יישום המגע השיורי (בדומה לבדיקה הביולוגית של בקבוק ה-CDC) היא בדיקה ביולוגית נפוצה של קוטל חרקים 8,9,10. עם זאת, השונות בנתונים משיטות אלה היא בדרך כלל גבוהה, כאשר המדידות של אותו זן יתושים במעבדה נעות בין כ-20-70% תמותה בבדיקות בקבוקים של CDC ו-0-50% בבדיקות הצינור של ארגון הבריאות העולמי כאשר הן נחשפות למינונים תת-קרקעיים11. שונות כזו מפתיעה משום שהשונות הגנטית המוגבלת ברוב זני המעבדה צפויה להוביל לשינויים מוגבלים ברגישות לקוטלי חרקים באוכלוסייה. עם זאת, עדיין יש רמה גבוהה של שונות שנצפתה בתוצאות הבדיקה הביולוגית.
מקורות פוטנציאליים לשונות זו יכולים להיות תוצאה של חשיפה לקוטלי חרקים הטרוגניים בין דגימות בתוך הבדיקה הביולוגית עקב חשיפה עקיפה של קוטל חרקים דרך פני השטח, השפעות סביבתיות הטרוגניות, שונות ביולוגית נורמלית בין פרטים מאותו גנוטיפ, ושונות במסת הדגימות של אותה אוכלוסייה12 . שיטה שנעשה בה שימוש לעתים רחוקות עם שכפול גבוה יותר היא הבדיקה הביולוגית של היישום המקומי. במבחן זה, קוטל החרקים מוחל ישירות על כל חרק13,14, ומסיר את גורם החשיפה ההטרוגנית של דגימות שונות בתוך אותה בדיקה. עם זאת, בשל אופי התפוקה האיטית של שיטה זו, היא אינה משמשת באופן שגרתי ככלי מעקב אחר רגישות לקוטלי חרקים עבור אוכלוסיות יתושים. מאמר זה מציג פרוטוקול שונה עבור היישום האקטואלי bioassay המאפשר חשיפות לתפוקה גבוהה יותר תוך תיקון לשונות במסת החרקים, פרמטר המתאם לשינויים ברגישות לקוטלי חרקים12. הפחתה ברעש ושונות הקשורה להמוניה בנתוני התמותה מחשיפה משתנה לקוטלי חרקים תאפשר מעקב עמידות טכני מדויק יותר11,15. נתונים כאלה יכולים לשמש כדי לקשר בצורה מדויקת יותר עמידות פנוטיפית עם סמנים גנטיים, פרמטרים של כושר ו/או יכולת וקטורית. בנוסף, אנו מדגימים כיצד ניתן היה להתאים את הבדיקה הזו בקלות למיני חרקים אחרים על ידי שימוש ביישום היישום המקומי bioassay על זבובי פירות, מין חרקים בעל גוף קטן יותר.
המגבלה העיקרית של יישומי המגע השיוריים הנ”ל היא שהחשיפה לקוטלי חרקים עשויה להשתנות מדגימה לדגימה בתוך אותו מבחן. במקרה של בדיקות ביולוגיות של בקבוק CDC ושיטת המגע, חשיפה לקוטלי חרקים עשויה להשתנות בין שכפולים של אותה בדיקה. החרקים נחשפים לקוטלי חרקים המופצים בחלק הפנימי של בקבוק זכוכית (בדיקה ביולוגית של בקבוק CDC ושיטת מגע) או על ניירות ספוגים (בדיקת שפופרת של ארגון הבריאות העולמי). הריכוז של קוטל חרקים בשני המשטחים (זכוכית ונייר) ידוע וקבע מראש על ידי סינון מינים שונים של גנוטיפים ידועים. עם זאת, הכמות הזמינה לספיגה פוטנציאלית על ידי החרק יכולה להשתנות מאוד בהתאם לפני השטח שבהם נעשה שימוש, מרכיבי תערובת קוטל החרקים, ועד כמה קוטל החרקים מופץ באופן הומוגני על פני השטח16,17. בבדיקה הביולוגית של בקבוק ה-CDC, ציפוי קוטל החרקים בחלק הפנימי של הבקבוק תלוי בהליכים המופעלים על ידי כל מעבדה ומשתמש. בבדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי, המאמרים שטופלו בקוטלי חרקים מיוצרים באופן מרכזי ולכן ככל הנראה הומוגניים למדי במעבדות. עם זאת, בבדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי, צינור החשיפה מאפשר לדגימות לנחות ולנוח על רשת מתכת שאינה חשופה לקוטלי חרקים, מה שמוביל לחשיפה פוטנציאלית לקוטלי חרקים הטרוגניים בקרב הדגימות בתוך כל בדיקה. עדיין יש לחקור את הכמות האמיתית של קוטל החרקים שנאספה ונספגה על ידי דגימות בכל שיטה בהמשך18.
בנוסף, הבדיקה הביולוגית של בקבוק ה-CDC, בדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי ושיטת המגע משמשים בדרך כלל כמבחני סף הבודקים רק ריכוז אחד קבוע מראש של קוטל חרקים. גישה זו יכולה לזהות במדויק את נוכחות ההתנגדות והיא בעלת ערך למעקב אחר התנגדות (במיוחד כאשר ההתנגדות מתפשטת). עם זאת, מבחני סף אינם יכולים לכמת את עוצמת ההתנגדות, מה שעשוי לנבא יותר את היעילות של כלי ההתערבות. אם משתמשים בריכוזי קוטל חרקים מרובים בשיטות אלה, ניתן להשתמש בהם כמבחני עוצמה. בדיקות אינטנסיביות עבור הבדיקה הביולוגית של בקבוק ה- CDC ובדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי הוצגו על ידי בדיקת פי 5 ופי 10 המינונים המפלים שנקבעו מראש כדי לטפל בפער זה במעקב 6,19. בעוד שהם מספקים יכולת גדולה יותר להבדיל בין אוכלוסיות עמידות, 3-5 מינונים (קבועים מראש) מספקים רזולוציה מוגבלת לחישוב ריכוזים קטלניים. בנוסף, יתושים בגדלים שונים משמשים במבחנים כאלה. עם זאת, חשוב למדוד את המסה מכיוון שדגימות גדולות יותר עשויות להזדקק למינון גבוה יותר כדי להיהרג מכיוון שהמינון האפקטיבי ליחידת מסה יהיה נמוך בהרבה מזה של אורגניזם קטן יותר12. חישוב מינון קטלני בעל יחסות המונית (כמות קוטל החרקים לכל מסת חרקים) יהיה מדד שימושי יותר מהריכוז הקטלני הנפוץ יותר (למשל, כמות קוטל החרקים לכל שטח פנים) מכיוון שהוא בוחן את השונות של מסת החרקים בין מינים, אוכלוסיות וגנוטיפים. נתונים כאלה יסייעו למלא את הפער בין עמידות גנוטיפית ופנוטיפית במעבדה ובשטח, ויכולים גם לספק דרך קלה לחשב את ריכוז היישום הדרוש לטיפול באוכלוסייה של חרקים בעלי מסה ממוצעת ידועה.
השימוש במינונים קטלניים בעלי יחסות המונית שהורגים 50% מהדגימות (LD50) משלב גם כמה יתרונות אחרים. הערכת הרעילות של תרכובת מסוימת במ”ג/ק”ג (= ng/mg) היא סטנדרטית בטוקסיקולוגיה אנושית ווטרינרית14, וערכי LD50 נמצאים בגיליונות נתוני בטיחות חומרים. מינונים קטלניים מאפשרים גם השוואה ישירה של רעילות בין כימיקלים שונים כלפי מין מסוים או אותו כימיקל כלפי מינים שונים20, כמו גם הערכה איכותית של קוטלי חרקים וכימיקלים חדשים13. בנוסף, ה-LD50 יכול לספק יחסי התנגדות משמעותיים ומדויקים יותר מאלה הנגזרים מתוצאות תמותה מינון אבחוני, מה שעלול לגרום להערכת יתר של רמת העמידות הקיימת באוכלוסייה. לכן, בדיקה זו תתאים לתוכניות מעקב שגרתיות על ידי מתן ניטור עמידות קפדני יותר המבוסס על מינונים קטלניים של יחסות מסה הנגזרים מדגימות רבות יותר ממה שמומלץ לבדיקות ביולוגיות אחרות21.
שיטת היישום המקומית שימשה במעקב אחר רגישות לקוטלי חרקים אחר יתושים וזבובים כחלופה לבדיקות הביולוגיות הסטנדרטיות של רגישות לקוטלי חרקים כאשר העמידות כבר ידועה או חשודהב-22,23, כמו גם למעקב אחר חרקים מזיקים מסוימים24 כדי להעריך בצורה מדויקת יותר פרופילי עמידות ורעילות פנימית של קוטל חרקים21 . בבדיקות ביולוגיות של יישומים מקומיים, קוטל החרקים מוחל על כל אורגניזם, וכתוצאה מכך נוצרת שונות מינימלית בחשיפה לקוטלי חרקים. מאמר זה מציג שיטה מעט מותאמת ומשופרת המאפשרת ליישם את החשיפה לקוטלי חרקים על מספר רב של חרקים בפרק זמן קצר תוך שליטה במסת החרקים22. שיטה זו עם תפוקה גבוהה יותר עם רמות טובות של שכפול יכולה להיות כלי שימושי נוסף למעקב שגרתי אחר רגישות לקוטלי חרקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם למבחן היישום האקטואלי עבור יתושים וזבובי פירות. הליך זה יכול להיות מותאם בקלות לשימוש בשטח ועם אורגניזמים אחרים כפי שהוא דורש ציוד מיוחד מינימלי. להלן השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה, שינויים פוטנציאליים, ייעוץ לפתרון בעיות, מגבלות השיטה ומשמעותה של שיטה זו.
שלבים קריטיים בפרוטוקול: ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול, שאם הם הושלמו באופן שגוי, יכולים להשפיע באופן דרסטי על תוצאות הבדיקה הביולוגית: דיוק ריכוז קוטל החרקים, נפילת הדגימות והערכת התמותה.
דיוק בריכוז קוטל החרקים:
חשוב מאוד שיהיו פתרונות מדויקים של קוטל חרקים כדי להשיג עקומות תגובת מינון הניתנות לשכפול ותוצאות משמעותיות. הגישה הנפחית להכנת תמיסת קוטל חרקים נפוצה יותר בספרות הן עבור הביו-אסאיקציה של בקבוק CDC7 והן עבור יישומים מקומיים 13,14,43. עם זאת, הגישה הגרווימטרית המתוארת כאן היא מטבעה מדויקת יותר בשל התחשבות בטמפרטורה באמצעות הכללת צפיפות (ספציפית לטמפרטורה), מה שמוביל להכנת פורמולציה מדויקת יותר.
נוק-דאון דגימה:
הפלת הדגימות היא מרכיב קריטי בשיטה זו ומאפשרת מתן מדויק של קוטל החרקים ומדידות המשקל. עם זאת, הפלת אורגניזמים מכילה בהכרח את הסיכון ללחץ פיזי ולנזק, כפי שהוכח בעבר30. לכן, היו זהירים ושמים לב כשאתם מפילים את הדגימות כדי להבטיח א) כל דגימה מופלת למשך זמן דומה, ב) אורך ההטלה נשמר למינימום, ו-3) שיטת ההטלה נשמרת עקבית בכל הדגימות. בנוסף, מומלץ לבחון את שיטת ההדחה בנפרד, לפני השימוש בקוטלי חרקים, כדי לוודא שהשיטה מוצלחת ואינה גורמת לתמותה מבוקרת העולה על 10%. הבדיקה הראשונית עשויה להימשך זמן רב יותר עבור משתמש לא מנוסה, מה שיוביל לזמני הורדה ארוכים יותר. לכן, היו זהירים בעת פירוש התוצאות מהמבחנים הראשונים.
הערכת תמותה:
הערכת התמותה יכולה להיות מאתגרת, במיוחד כאשר קוטל החרקים אינו הורג לחלוטין אלא רק מפיל או מפיל את היתוש או הזבוב. לכן, חשוב להיות מודעים לאופן שבו קוטל החרקים משפיע על אורגניזם המטרה ויש להם הגדרה ברורה לאורגניזמים “מתים” (או מופלים) לפני שמתחילים. בנוסף, מומלץ שאותו אדם יעריך תמותה בין מינונים ומשכפלים כדי להפחית את השונות.
שינויים בפרוטוקול: ניתן להחיל מספר שינויים המתוארים להלן על פרוטוקול זה כדי לשפר את הרבגוניות והנגישות שלו.
התאמת הבדיקה לחרקים קטנים או גדולים יותר:
בעת שימוש בדגימות קטנות או גדולות יותר, מומלץ להחיל כמות קטנה יותר או גדולה יותר של קוטל חרקים, בהתאמה. לדוגמה, התאמנו את פרוטוקול היתושים לזבובי פירות על ידי הפחתת המינון של 0.5 μL למינון של 0.2 μL. ודא שגודל המזרק הנכון נבחר עבור נפח המינון שנבחר.
התאמת הבדיקה לחרקים בשטח:
כאשר משתמשים בחרקי שדה, ייתכן שיש שונות רבה יותר בגודל החרקים. לכן, מומלץ לשקול את החרקים בקבוצות קטנות יותר (למשל, לכל כוס) במקום כקבוצה גדולה (למשל, כל החרקים המשמשים לניסוי אחד). זה יכול לעזור ללכוד את השונות הפוטנציאלית ברגישות לקוטלי חרקים הקשורים להבדלים במסת החרקים בשדה.
שינויים בציוד:
אוהל לטיפול בחרקים: ניתן להשלים את מינון הדגימה תחת אוהל לטיפול בחרקים שנבנה בפשטות עם צינור PVC וכילות נגד יתושים. זה יכול להיות חלופה לחדר סגור (למשל, חרקים) ולעזור למנוע זיהום פוטנציאלי של קוטל חרקים באזורים שבהם עלול להתרחש גידול חרקים. אוהל זה לטיפול בחרקים קל לבנייה ובעלות נמוכה (כ-70 דולר). לחלופין, ניתן לרכוש כלוב לטיפול בחרקים (כ-425 דולר).
שולחן צונן: חבילות קרח או מגשי קרח יכולים לשמש להפלת הדגימה ו/או להפלת הדגימה ו/או להפלת הדגימה.
אינקובטור: אינקובטורים מומלצים לגידול הדגימה ולהחזקת הדגימה במשך 24 שעות לאחר הטיפול בקוטלי חרקים. אם אינקובטור אינו זמין, ניתן לבנות אותו. הציוד הדרוש לבניית החממה כולל מיכל מבודד, מכשיר אדים, כבלי חום, בקר לחות וטמפרטורה, ואור, שאמור להסתכם בעלות כוללת של כ-170 דולר, בהמשך להרחבה של שיטות קודמות44.
מחזיקי כוסות: למרות שכוסות פלסטיק משמשות למיון והחזקה של הדגימה המטופלת, כוסות נייר מרופדות שעווה או מיכלי זכוכית יהיו חלופות מתאימות.
אורגניזם ושינוי שלב החיים:
שיטה זו ניתנת להתאמה רבה לשימוש עם וקטורים אחרים, חרקים ו /או פרוקי רגליים כגון יתושי Culex quinquefasciatus 32, זבובי בית32, וג’וקים45, כמו גם שלבי חיים שאינם בוגרים, כגון זחלי יתושים46.
שינוי מיקום יישום אקטואלי:
שיטה זו מתארת את מריחת קוטל החרקים על בית החזה הגחוני ואזור הבטן עבור יתושים (ואת הגב עבור זבובי פירות). עם זאת, ניתן להשתמש במיקומי יישומים אחרים כל עוד אתר החשיפה עקבי. העקביות חשובה מכיוון שהרגישות לקוטלי חרקים יכולה להשתנות בהתאם למיקום היישום32.
עצות לפתרון בעיות: לשיטה זו יש כמה שלבים שהם בתחילה מאתגרים. להלן כמה מהבעיות הנפוצות ביותר שאדם עלול להיתקל בהן.
תמיסות קוטל חרקים דולפות/מתאדות:
קוטלי חרקים מומסים בדרך כלל באצטון, תרכובת נדיפה מאוד. משמעות הדבר היא שאצטון מתאדה במהירות בטמפרטורת החדר, מה שמגדיל את ריכוזי קוטל החרקים עם הזמן. אם נראה כי תמיסות קוטל החרקים דולפות או מתאדות, יש ליצור מחדש את התמיסות, לוודא שהמכסה של הצינור דולק היטב, ולבדוק שוב שפרוטוקולי האחסון מתבצעים כראוי (למשל, נעשה שימוש בפרפילם, והצינורות מאוחסנים זקופים). אם הדליפה נמשכת, נסו למלא את הצינורות בנפח נמוך יותר כדי לאפשר יותר מקום לשינוי בנפח שהאצטון חווה בטמפרטורות שונות. בנוסף, אם אתם משתמשים באצטון כממס, ודאו שהצינורות מדורגים לאחסון אצטון (למשל, פלסטיק FEP, TFE ו-PFA). אם אתם משתמשים בקוטלי חרקים הידרופוביים, אחסנו את התמיסות בבקבוקוני זכוכית (שכן קוטלי חרקים הידרופוביים נדבקים לזכוכית פחות מפלסטיק). זה גם תרגול טוב לסמן את המניסקוס של הפתרון לפני האחסון כדי לפקח על אידוי.
משקל נסחף על מיקרו-איזון בעת שקילה של אורגניזמים:
אם קריאת המשקל בסולם נסחפת (לאט לאט עולה או יורדת), זה יכול להיות בגלל סטטי. סחף מתרחש לרוב כאשר שוקלים אורגניזמים בפריטי פלסטיק, שכן פלסטיק יכול בקלות להחזיק מטען סטטי. כדי להימנע מכך, ניתן להניח נייר שקילה מתחת למיכל הפלסטיק הנשקל, או להשתמש במיכל שאינו פלסטיק כגון זכוכית.
תוצאות תמותה חריגות:
ישנן דרכים רבות שבהן תוצאות התמותה עשויות להיראות חריגות, כגון התבוננות בתמותה גבוהה בבקרה או תמותה גבוהה/נמוכה בכל מינוני קוטל החרקים. סקור את המקרים הבאים לפתרון בעיות בכל תרחיש.
תמותה בשליטה גבוהה
אם יש תמותה גבוהה בקבוצת הביקורת (10% או יותר), העריכו את שיטת ההפלה ואת משך הזמן שבו הדגימות מופלות. במידת האפשר, לקצר את משך הזמן שבו הדגימות מופלות. גורמים פוטנציאליים אחרים שיש לקחת בחשבון עבור תמותה גבוהה בבקרות כוללים i) בדיקה אם הגדרות האינקובטור נכונות – טמפרטורות ו/או לחות חריגות עלולות להוביל לתמותה מוגברת. יש לבדוק את הטמפרטורה והלחות עם אוגר נתונים עצמאי. 2) הערכת טיפול בחרקים. טיפול בחרקים יותר מדי או גס מדי עלול להוביל לתמותה גבוהה. 3) בדיקה אם אין זיהום קוטל חרקים ב-100% אצטון המשמש לטיפול בקבוצת הביקורת או במכשור. החלף אצטון ונקה את כל המכשירים באצטון או באתנול. הימנע מזיהום על ידי החלפת כפפות לעתים קרובות, מניעת שפיכה וחומרי ניקוי. שים לב שבקובץ משלים 3, מקסימום שני יתושים מתו בתוך כוסות הבקרה (אצטון בלבד). רמה זו של תמותה אינה נחשבת גבוהה (היא פחות מ -10%), ולכן, לא היתה סיבה לדאגה.
תמותה גבוהה בכל הקבוצות שנחשפו (אך לא בקבוצות ביקורת)
השתמש בריכוזי קוטל חרקים נמוכים יותר או בנפחי מינון קטנים יותר לבדיקה. המינונים שבהם נעשה שימוש עשויים להיות מעל המינון המינימלי שלא יגרום לתמותה. השתמש במספר דילולים של פי 10 כדי לזהות את טווח המינונים הנכון, ולשלול זיהום. כדי למנוע זיהום, התחילו במינון עם הריכוז הנמוך ביותר ועבדו לקראת הריכוז הגבוה ביותר. בנוסף, וודאו שכל הציוד שבו נעשה שימוש מנוקה באופן קבוע עם אצטון ו/או אתנול, המינונים המיושמים על הדגימה קטנים מאוד, ואפילו הזיהום הצולב הקל ביותר עלול להשפיע על התוצאות.
תמותה נמוכה בכל הקבוצות שנחשפו
השתמש בריכוזי קוטל חרקים גבוהים יותר. המינונים שבהם נעשה שימוש עשויים להיות נמוכים מדי מכדי לגרום לתמותה באוכלוסייה. כדי לזהות את טווח המינונים הנכון, יש לחשוף את הדגימות למספר מינונים מרוכזים פי 10 נוספים. ודא שתמיסות קוטל החרקים לא פג תוקפן או התדרדרו (ייתכן שבשל טמפרטורה גבוהה או חשיפה לאור). אם תוקפם של הפתרונות פג או שהם חשודים בפגיעה, תכננו מחדש את הפתרונות וודאו שתנאי אחסון נאותים מתקיימים.
תמותה לא עקבית בין שכפולים/ימים
השעה ביום שבה חרקים נחשפים לקוטל החרקים עלולה להשפיע על רמת העמידות המובעת, במיוחד לעמידות מטבולית34. חזור על פרוטוקול זה באותו חלון זמן בכל יום כדי להימנע משעה ביום כמשתנה פוטנציאלי התורם לשינויים בתמותה. גורמים פוטנציאליים אחרים התורמים לתמותה לא עקבית בין שכפולים כוללים א) דגימות שגודלו באופן דיפרנציאלי בין ניסויים. ודא שכל הדגימות הן מאותו טווח גילאים, מגודלות באותה טמפרטורה ובצפיפויות ובזמינות מזון דומות. ii) ריכוזי קוטל החרקים מתדרדרים עם הזמן או הופכים מרוכזים יותר עקב אידוי אצטון. תכננו מחדש את הפתרונות והבטיחו תנאי אחסון נאותים. 3) ניקוד תמותה לא עקבי. ודא שאותו אדם נותן ציונים לתמותה או לפתח פרוטוקול ברור שישמש באופן עקבי ברחבי הצוות. השתמש בניקוד עיוור כדי להפחית את ההטיה בניקוד התמותה.
חרקים הנדבקים לפני השטח של מגש המיון:
אצטון מגיב לפלסטיק המשמש בפרוטוקול זה, כגון צלחות פטרי. הדגימה ככל הנראה תיצמד לפני השטח אם תשתמש באצטון על צלחות פטרי או על משטחי פלסטיק דומים. ניתן להימנע מהדבקה זו על ידי ציפוי מגש המיון בנייר שקילה או שימוש במגש מיון שאינו פלסטיק. בנוסף, עיבוי על פני הפלסטיק במגש המיון או החזקת כוסות עלול לגרום לחרקים להיצמד לעיבוי, או שהדגימה עלולה להיות קרה מדי ועלולה לקפוא על פני השטח. התאם את שיטת ההטלה כדי להפחית את העיבוי תוך מניעת התקררות/הקפאה של הדגימות (לדוגמה, הנח נייר שקילה בין הדגימות למגש המיון מפלסטיק).
שגיאות ניתוח R:
לאחר איסוף נתוני התמותה, עלולים להתרחש מגוון סיבוכים במהלך הניתוח. הסיבה הנפוצה ביותר לכך שקוד R אינו יכול להשלים את הפעולות עבור קובץ הנתונים היא שתבנית הנתונים אינה תואמת לקוד (לדוגמה, כותרות עמודות ו/או תאים ריקים). אם מתעוררים סיבוכים חמורים יותר, עיין בדפי העזרה של R המובנים ב- Rstudio35.
מגבלות של שיטת היישום האקטואלית שתוארה לעיל:
ספיגת קוטל חרקים בשיטת יישום חיצוני אינה מחקה חשיפה טבעית:
יישום מקומי על הגוף הראשוני אינו הדרך הטבעית של ספיגת קוטל חרקים. בשטח, חרקים סופגים בעיקר קוטלי חרקים דרך רגליהם לאורך זמן שהם נמצאים במגע עם המשטח שטופל בקוטלי חרקים או על כנפיהם דרך חלקיקי אירוסול קטנים47,48, במקום חשיפה מהירה על פני הגחון. עם זאת, היישום הישיר של מינון קוטל חרקים ידוע יקבע במדויק תגובה פנוטיפית לקוטלי חרקים, הדרושה למחקרים גנטיים ואבולוציוניים או להשוואות של רגישות לקוטלי חרקים במרחב או בזמן. לכן, גישה זו מועילה לבדיקת התנגדות טכנית אך לא תמדוד ישירות התנגדות מעשית (היעילות של כלי ההתערבות בפועל בהגדרת שדה15). עם זאת, חשוב לציין כי השיטות הסטנדרטיות הנוכחיות (למשל, בדיקות שפופרת של ארגון הבריאות העולמי ובדיקות ביולוגיות של בקבוקי CDC) גם אינן יכולות ללכוד או לחקות חשיפה לאירוסול (כלומר, על ידי ערפול) של קוטל חרקים בשטח.
בדיקות יישום אקטואליות יכולות להעריך רק קוטלי חרקים לספיגת מגע:
שיטה זו מיועדת לקוטלי חרקים הפועלים באמצעות מגע וספיגה של קוטל החרקים ולא לשימוש בקוטלי חרקים דרך הפה, כגון חומצה בורית המשמשת בדרך כלל בפיתיונות סוכר רעילים אטרקטיביים49.
משמעות השיטה:
שיטת היישום המקומית מרחיבה את הסטנדרטים המבוססים היטב עבור בדיקות ביולוגיות של קוטל חרקים על ידי חישוב המינון הקטלני (לא ריכוז) ומדידת עמידות טכנית (לא מעשית)15. להלן היתרונות והחסרונות של שיטה זו על פני מבחני רגישות קיימים לקוטלי חרקים.
חישוב מינון קטלני:
שיטה זו קובעת את המינון הקטלני של קוטל החרקים, ולא את הריכוז הקטלני שבו משתמשים המבחנים הביולוגיים של ה-CDC וארגון הבריאות העולמי כדי לקבוע את המינון המפלה11. המינון הקטלני משמעותי יותר מכיוון שהוא כמות מכמתת של קוטל חרקים הידועה כמעוררת תמותה. לעומת זאת, הריכוז הקטלני אינו לוקח בחשבון כמה קוטל חרקים האורגניזם רוכש בפועל. בעת שימוש בחישוב המינון הקטלני, ניתן לראות ולכמת בצורה מדויקת יותר הבדלים בין פרופילי רגישות תלויי מין או גודל, מה שהופך את המדידה הזו לרב-תכליתית עוד יותר.
התנגדות טכנית:
שיטה זו מעריכה את ההתנגדות הטכנית, שהיא התנגדות כפי שהיא נמדדת בסביבות סטנדרטיות ומבוקרות. מדידות כאלה מתאימות למעקב אחר התפשטות עמידות לקוטלי חרקים וקישור עמידות פנוטיפית עם סמנים פוטנציאליים15. בגלל הירידה בשונות בתמותה כתוצאה מבדיקת הביו-בדיקה של היישום המקומי, היא מאפשרת זיהוי טוב יותר של סמני התנגדות חדשים. עם זאת, בשל חשיפה לא טבעית של קוטלי חרקים ליתוש, בדיקה זו אינה מתאימה להערכת היעילות של התערבות ספציפית באוכלוסייה מסוימת. יש צורך במבחנים אחרים למדידות של התנגדות מעשית כזו15.
יכולת הסתגלות הדגימה:
ניתן לתרגל שיטה זו על פרוקי רגליים חשובים אחרים כגון מזיקים חקלאיים (למשל, חיפושית תפוחי אדמה מקולורדו), מזיקים ביתיים (למשל, ג’וקים ופשפשי מיטה), או מאביקים (למשל, דבורים) עם שינויים פשוטים בגישת ההדחה ו/או במינון קוטל החרקים, בנפח ו/או בריכוז (כמתואר לעיל). קלות ההסתגלות יכולה לסייע באנלוגיה של מחקר עמידות לקוטלי חרקים בתחומי מחקר שונים. השימוש בערך LD50 במקום בריכוז קטלני שהורג 50% מהדגימות (LC50) מאפשר השוואה מדויקת בין מינים.
עלות:
בדומה לבדיקות ביולוגיות של בקבוקי CDC ובדיקות שפופרת של ארגון הבריאות העולמי, העלויות להפעלת בדיקת היישום המקומית הן מינימליות (ראו טבלת החומרים). פריטי הציוד החיוניים הם המזרק (כ-70 דולר) והמתקן (כ-100 דולר), הניתנים לשימוש חוזר במבחנים.
מספר הדגימות הדרושות:
יש להשתמש במינימום של 20-25 דגימות לכל בדיקה של יישום מקומי. מומלץ לבחון לפחות חמישה ריכוזי קוטל חרקים בכל ניסוי, עם מינימום של שלושה שכפולים המומלצים להליך. בסך הכל, התוצאה היא מינימום של 300-375 דגימות הדרושות לבדיקה מלאה, בדומה למספר הדגימות הדרושות לביצוע בדיקות עוצמת התנגדות באמצעות בדיקות שפופרת של ארגון הבריאות העולמי או בדיקות ביולוגיות של בקבוק CDC. עם זאת, אם השתנות מופחתת מושגת באמצעות הבדיקה הביולוגית של היישום המקומי, אותו מספר דגימות עשוי להוביל לעוצמה סטטיסטית רבה יותר כדי להשוות נתוני רגישות על פני מרחב או זמן.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי פרס CAREER על ידי הקרן הלאומית למדע ל- SH תחת מספר הפרס 2047572. אנו מודים לדמיאן ריברה על עזרתו בגידול זבוב הפירות והכנתו לבדיקת יישומים מקומיים, לד”ר גנסקי מאוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון על שיתוף זן זבוב הפירות שלו Canton-S, למרכזים לבקרת מחלות ומניעתן על שיתוף זן הרוקפלר, ולמרכז לאנטומולוגיה חקלאית ווטרינרית של משרד החקלאות של ארצות הברית על שיתוף זן האיזולין IICC. איור 1 נוצר עם BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T., Roush, R. T., Tabashnik, B. E. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
