Topische Anwendung Bioassay zur Quantifizierung der Insektizidtoxizität für Moskitos und Fruchtfliegen
Summary
Wir beschreiben die Methodik und Bedeutung des topischen Anwendungsbioassays zur Messung der Insektizidempfindlichkeit bei Moskitos und Fruchtfliegen. Der vorgestellte Assay ist ein hoher Durchsatz, verwendet Insektenmasse – so dass eine massenrelativierte tödliche Dosis anstelle der Konzentration berechnet werden kann – und hat wahrscheinlich eine geringere Variabilität als andere ähnliche Methoden.
Abstract
Der fortgesetzte Einsatz von Insektiziden für die öffentliche Gesundheit und die Landwirtschaft hat zu einer weit verbreiteten Insektizidresistenz und Behinderung der Bekämpfungsmethoden geführt. Die Überwachung der Insektizidresistenz von Mückenpopulationen erfolgt in der Regel durch Flaschenbioassays der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) oder Tubentests der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Diese Methoden können jedoch zu einer hohen Variabilität der Mortalitätsdaten führen, da der Kontakt mit dem Insekt variabel ist, die relativ geringe Anzahl der getesteten Organismen, die große Variation der Masse zwischen den Populationen und die sich ständig ändernden Umweltbedingungen, die zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. In diesem Artikel wird der topische Anwendungsbioassay vorgestellt, der als phänotypischer Hochdurchsatz-Bioassay für Moskitos und Fruchtfliegen geeignet ist, um eine große Anzahl von Insekten entlang einer Reihe von Insektizidkonzentrationen zu testen.
Dieser Assay 1) gewährleistet eine konsistente Behandlung und den Kontakt mit Insektiziden mit jedem Organismus, 2) erzeugt hochspezifische Dosis-Wirkungs-Kurven, die Unterschiede in der Durchschnittsmasse zwischen Stämmen und Geschlechtern berücksichtigen (was besonders für im Feld gesammelte Organismen wichtig ist), und 3) ermöglicht die Berechnung statistisch strenger mittlerer tödlicher Dosen (LD50 ), die für Vergleiche des Resistenzverhältnisses notwendig sind – ein alternativer Überwachungsansatz aus der diagnostischen Dosismortalität, der auch für die Überwachung der Larvizidresistenz verwendet wird. Dieser Assay wird ein ergänzendes Werkzeug für die genaue Phänotypisierung von Mückenpopulationen sein und, wie mit Fruchtfliegen veranschaulicht, leicht für die Verwendung mit anderen Insekten angepasst werden können. Wir argumentieren, dass dieser Assay dazu beitragen wird, die Lücke zwischen genotypischer und phänotypischer Insektizidresistenz bei mehreren Insektenarten zu schließen.
Introduction
Moskitos sind jedes Jahr für über 700.000 Todesfälle aufgrund der Krankheiten verantwortlich, die sie auf den Menschen übertragen, wobei mehr als die Hälfte dieser Todesfälle allein auf Malaria zurückzuführenist 1. Die wichtigste vorbeugende Methode gegen die Übertragung von Malaria und anderen vektorübertragenen Krankheiten ist die Verwendung von Insektiziden, oft in Form von lang anhaltenden Insektizidnetzen oder Indoor-Restsprühen2. Die Insektizidresistenz ist jedoch bei Moskitos und anderen Insektenvektoren sowie bei landwirtschaftlichen Schädlingenweit verbreitet 3,4. Um den Widerstand effektiv zu bewältigen, ist die Überwachung von zentraler Bedeutung5. Dazu werden hochgenaue und hochdurchlässige Widerstandsdetektionsmethoden benötigt. Derzeit sind die am weitesten verbreiteten Überwachungsinstrumente für Insektizidresistenzen für Moskitos der WHO-Röhrentest 6 und der CDC-Flaschenbioassay7. Für Fruchtfliegen ist die Restkontakt-Applikationsmethode (ähnlich dem CDC-Flaschen-Bioassay) ein häufig verwendeter Insektizid-Bioassay 8,9,10. Die Variabilität der Daten aus diesen Methoden ist jedoch typischerweise hoch, wobei die Messungen desselben Labormückenstamms von ~ 20-70% Mortalität in CDC-Flaschentests und 0-50% in WHO-Röhrchentests reichen, wenn sie subletalen Dosierungen ausgesetzt sind11. Eine solche Variation ist überraschend, da die begrenzte genetische Variation in den meisten Laborstämmen voraussichtlich zu einer begrenzten Variation der Insektizidanfälligkeit in der Population führen wird. Dennoch gibt es immer noch ein hohes Maß an Variation, das in den Bioassay-Ergebnissen beobachtet wird.
Mögliche Quellen dieser Variation könnten das Ergebnis einer heterogenen Insektizidexposition zwischen Proben innerhalb des Bioassays sein, die auf eine indirekte Insektizidexposition über die Oberfläche, heterogene Umweltauswirkungen, normale biologische Variationen zwischen Individuen desselben Genotyps und Variationen in der Masse von Proben derselben Population zurückzuführenist 12 . Eine selten verwendete Methode mit höherer Replizierbarkeit ist der topische Applikationsbioassay. In diesem Assay wird das Insektizid direkt auf jedes Insekt13,14 aufgetragen, wodurch der Faktor der heterogenen Exposition verschiedener Proben innerhalb desselben Assays entfernt wird. Aufgrund des langsamen Durchsatzes dieser Methode wird sie jedoch nicht routinemäßig als Insektizid-Suszeptibilitätsüberwachungsinstrument für Mückenpopulationen verwendet. Dieses Papier stellt ein modifiziertes Protokoll für den topischen Anwendungsbioassay vor, das eine höhere Durchsatzexposition ermöglicht und gleichzeitig die Variation der Insektenmasse korrigiert, ein Parameter, der mit Änderungen der Insektizidempfindlichkeit korreliert12. Eine Verringerung des Lärms und der massenbedingten Variation der Mortalitätsdaten aufgrund der variablen Insektizidexposition würde eine genauere Überwachung der technischen Resistenzen ermöglichen11,15. Solche Daten könnten verwendet werden, um phänotypische Resistenzen genauer mit genetischen Markern, Fitnessparametern und/oder Vektorkompetenz in Verbindung zu bringen. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Assay leicht an andere Insektenarten angepasst werden kann, indem der topische Anwendungsbioassay an Fruchtfliegen, einer kleineren Insektenart, verwendet wird.
Die Haupteinschränkung der oben genannten Restkontaktanwendungen besteht darin, dass die Insektizidexposition von Probe zu Probe innerhalb desselben Assays variieren kann. Im Falle von CDC-Flaschenbioassays und der Kontaktmethode kann die Insektizidexposition zwischen Replikaten desselben Assays variieren. Die Insekten sind einem Insektizid ausgesetzt, das entweder auf der Innenseite einer Glasflasche (CDC-Flaschenbioassay und Kontaktmethode) oder auf imprägnierten Papieren (WHO-Röhrchentest) verteilt ist. Die Konzentration von Insektiziden auf beiden Oberflächen (Glas und Papier) ist bekannt und durch das Screening verschiedener Arten bekannter Genotypen vorbestimmt. Die Menge, die zur potenziellen Aufnahme durch das Insekt zur Verfügung steht, kann jedoch stark variieren, abhängig von der verwendeten Oberfläche, den Insektizidmischungskomponenten und der Homogenität des Insektizids über das Oberflächenmaterial16,17. Beim CDC-Flaschenbioassay hängt die Insektizidbeschichtung auf der Innenseite der Flasche von den Verfahren ab, die von jedem Labor und Benutzer angewendet werden. Beim WHO-Tubentest werden die mit Insektiziden behandelten Papiere zentral produziert und sind damit höchstwahrscheinlich in den Labors recht homogen. Beim WHO-Tubentest ermöglicht das Belichtungsröhrchen den Proben jedoch, auf einem nicht mit Insektiziden belichteten Metallgewebe zu landen und sich dort auszuruhen, was zu einer potenziellen heterogenen Insektizidexposition unter den Proben innerhalb jedes Tests führt. Die tatsächliche Menge an Insektizid, die von Proben über jede Methode aufgenommen und absorbiert wird, muss noch weiter erforscht werden18.
Darüber hinaus werden der CDC-Flaschenbioassay, der WHO-Röhrchentest und die Kontaktmethode am häufigsten als Schwellenassays verwendet, um nur eine vorbestimmte Insektizidkonzentration zu testen. Dieser Ansatz kann das Vorhandensein von Resistenzen genau erkennen und ist wertvoll für die Widerstandsüberwachung (insbesondere wenn sich der Widerstand ausbreitet). Schwellenwert-Assays können jedoch die Stärke der Resistenz nicht quantifizieren, was die Wirksamkeit von Interventionsinstrumenten besser vorhersagen könnte. Wenn mit diesen Methoden mehrere Insektizidkonzentrationen verwendet werden, können sie als Intensitätstests verwendet werden. Intensitätstests für den CDC-Flaschenbioassay und den WHO-Röhrchentest wurden eingeführt, indem 5x und 10x der vorgegebenen diskriminierenden Dosierungen getestet wurden, um diese Lücke in der Überwachung zu schließen 6,19. 3-5 (vorbestimmte) Dosierungen bieten zwar eine bessere Möglichkeit, zwischen resistenten Populationen zu unterscheiden, bieten jedoch eine begrenzte Auflösung zur Berechnung tödlicher Konzentrationen. Darüber hinaus werden Moskitos verschiedener Größen in solchen verwendetSays. Es ist jedoch wichtig, die Masse zu messen, da größere Proben möglicherweise eine höhere Dosis benötigen, um getötet zu werden, da die effektive Dosis pro Masseneinheit viel niedriger ist als die eines kleineren Organismus12. Die Berechnung einer massenrelativierten tödlichen Dosis (Menge an Insektizid pro Insektenmasse) wäre eine nützlichere Metrik als die häufigere tödliche Konzentration (z. B. Menge an Insektizid pro Oberfläche), da sie die Variation der Insektenmasse zwischen Geschlechtern, Populationen und Genotypen berücksichtigt. Solche Daten würden dazu beitragen, die Lücke zwischen genotypischer und phänotypischer Resistenz innerhalb des Labors und des Feldes zu schließen, und könnten auch eine einfache Möglichkeit bieten, die erforderliche Anwendungskonzentration zur Behandlung einer Population von Insekten mit einer bekannten durchschnittlichen Masse zu berechnen.
Die Verwendung von massenrelativierten tödlichen Dosierungen, die 50% der Proben töten (LD50), beinhaltet auch mehrere andere Vorteile. Die Beurteilung der Toxizität einer bestimmten Verbindung in mg/kg (= ng/mg) ist Standard in der Human- und Veterinärtoxikologie14, und LD50-Werte sind auf Sicherheitsdatenblättern zu finden. Tödliche Dosierungen ermöglichen auch einen direkten Vergleich der Toxizität zwischen verschiedenen Chemikalien für eine bestimmte Spezies oder derselben Chemikalie gegenüber verschiedenen Spezies20 sowie eine qualitativ hochwertige Bewertung neuartiger Insektizide und Chemikalien13. Darüber hinaus kann die LD50 aussagekräftigere und genauere Resistenzverhältnisse liefern als diejenigen, die aus diagnostischen Dosismortalitätsergebnissen abgeleitet werden, was zu einer Überschätzung des in einer Population vorhandenen Resistenzniveaus führen kann. Daher wäre dieser Assay für routinemäßige Überwachungsprogramme geeignet, da er eine strengere Resistenzüberwachung auf der Grundlage von massenrelativierten tödlichen Dosen bietet, die von mehr Proben stammen, als für andere Bioassaysempfohlen werden 21.
Die topische Applikationsmethode wurde in der Insektizid-Suszeptibilitätsüberwachung für Moskitos und Fliegen als Alternative für die Standard-Insektizid-Suszeptibilitäts-Bioassays verwendet, wenn die Resistenz bereits bekannt ist oder vermutetwird 22,23, sowie für die Überwachung bei einigen Schädlingsinsekten24 zur genaueren Beurteilung von Resistenzprofilen und intrinsischer Toxizität von Insektiziden 21 . Bei Bioassays zur topischen Anwendung wird das Insektizid auf jeden Organismus aufgetragen, was zu einer minimalen Variation der Insektizidexposition führt. Dieses Papier stellt eine leicht angepasste und verbesserte Methode vor, die es ermöglicht, in kurzer Zeit eine Insektizidexposition auf eine große Anzahl von Insekten anzuwenden und gleichzeitig die Insektenmasse zu kontrollieren22. Diese Methode mit höherem Durchsatz und guter Replizierbarkeit könnte ein nützliches zusätzliches Werkzeug für die routinemäßige Überwachung der Insektizidanfälligkeit sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier stellt ein angepasstes Protokoll für den topischen Applikationsassay für Mücken und Fruchtfliegen vor. Dieses Verfahren könnte leicht angepasst werden, um im Feld und mit anderen Organismen verwendet zu werden, da es nur minimale Spezialausrüstung erfordert. Im Folgenden werden die kritischen Schritte dieses Protokolls, mögliche Änderungen, Ratschläge zur Fehlerbehebung, Einschränkungen der Methode und die Bedeutung dieser Methode behandelt.
Kritische Schritte im Protokoll: Es gibt drei kritische Schritte im Protokoll, die, wenn sie falsch ausgeführt werden, die Ergebnisse des Bioassays drastisch beeinflussen können: Genauigkeit der Insektizidkonzentration, Probenabschlag und Mortalitätsbewertung.
Genauigkeit der Insektizidkonzentration:
Es ist äußerst wichtig, genaue Insektizidlösungen zu haben, um replizierbare Dosis-Wirkungs-Kurven und aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Der volumetrische Ansatz zur Herstellung von Insektizidlösungen ist in der Literatur sowohl für CDC-Flaschenbioassay 7 als auch für topische Anwendungen13,14,43 gebräuchlicher. Der hier beschriebene gravimetrische Ansatz ist jedoch aufgrund der Berücksichtigung der Temperatur durch die Einbeziehung der (temperaturspezifischen) Dichte von Natur aus genauer, was zu einer genaueren Formulierungsvorbereitung führt.
Proben-Knockdown:
Das Abschlagen der Proben ist ein kritischer Bestandteil dieser Methode und ermöglicht die genaue Verabreichung der Insektizid- und Gewichtsmessungen. Das Abschlagen von Organismen birgt jedoch unweigerlich das Risiko von körperlichem Stress und Schäden, wie bereits gezeigt30. Seien Sie daher vorsichtig und achtsam, wenn Sie die Proben niederschlagen, um sicherzustellen, dass i) jedes Exemplar für eine ähnliche Dauer niedergeschlagen wird, ii) die Länge des Knockdowns auf ein Minimum beschränkt ist und iii) die Methode des Knockdowns bei allen Proben konsistent gehalten wird. Darüber hinaus wird empfohlen, die Knockdown-Methode vor der Anwendung von Insektiziden separat zu testen, um sicherzustellen, dass die Methode erfolgreich ist und keine Kontrollmortalität von mehr als 10% induziert. Der anfängliche Test kann für einen unerfahrenen Benutzer länger dauern, was zu längeren Knockdown-Zeiten führt. Seien Sie daher vorsichtig bei der Interpretation der Ergebnisse der ersten Assays.
Mortalitätsbewertung:
Die Beurteilung der Mortalität kann eine Herausforderung sein, insbesondere wenn das Insektizid die Mücke oder Fliege nicht vollständig tötet, sondern nur niederschlägt oder verstümmelt. Daher ist es wichtig, sich darüber im Klaren zu sein, wie sich das Insektizid auf den Zielorganismus auswirkt, und eine klare Definition für “tote” (oder niedergeschlagene) Organismen zu haben, bevor Sie beginnen. Darüber hinaus wird empfohlen, dieselbe Person die Mortalität zwischen Dosen und Replikationen beurteilen zu lassen, um die Variation zu reduzieren.
Protokolländerungen: Mehrere unten beschriebene Änderungen können auf dieses Protokoll angewendet werden, um seine Vielseitigkeit und Zugänglichkeit zu verbessern.
Anpassung des Assays an kleinere oder größere Insekten:
Bei der Verwendung kleinerer oder größerer Proben wird empfohlen, ein kleineres bzw. größeres Dosisvolumen an Insektiziden aufzutragen. Als Beispiel haben wir das Mückenprotokoll an Fruchtfliegen angepasst, indem wir die 0,5-μL-Dosis auf eine Dosis von 0,2 μL reduziert haben. Stellen Sie sicher, dass die richtige Spritzengröße für das gewählte Dosisvolumen ausgewählt ist.
Anpassung des Assays an Feldinsekten:
Bei der Verwendung von Feldinsekten kann es zu mehr Variationen in der Insektengröße kommen. Daher wäre es empfehlenswert, die Insekten in kleineren Gruppen (z. B. pro Tasse) zu wiegen, anstatt als große Gruppe (z. B. alle Insekten, die für ein Experiment verwendet werden). Dies kann dazu beitragen, die potenzielle Variation der Insektizidanfälligkeit zu erfassen, die mit den Unterschieden in der Insektenmasse im Feld verbunden ist.
Modifikationen der Ausrüstung:
Insekten-Handling-Zelt: Die Dosierung der Probe kann unter einem Insekten-Handling-Zelt durchgeführt werden, das einfach mit PVC-Rohr und Moskitonetz gebaut wird. Dies kann eine Alternative zu einem geschlossenen Raum (z. B. insektär) sein und dazu beitragen, eine mögliche Insektizidkontamination in Bereichen zu beseitigen, in denen Insektenaufzucht auftreten könnte. Dieses Insekten-Handling-Zelt ist einfach zu konstruieren und kostengünstig (~ $ 70). Alternativ könnte ein Insektenkäfig gekauft werden (~ $ 425).
Kühltisch: Eisbeutel oder Eisschalen können verwendet werden, um die Probe niederzuschlagen und / oder die Probe niedergeschlagen zu halten.
Inkubator: Inkubatoren werden empfohlen, um das Exemplar aufzuziehen und das Exemplar nach der Insektizidbehandlung 24 h lang zu halten. Wenn kein Inkubator verfügbar ist, kann er gebaut werden. Die Ausrüstung, die für den Bau des Inkubators benötigt wird, umfasst einen isolierten Behälter, einen Luftbefeuchter, Wärmekabel, einen Feuchtigkeits- und Temperaturregler sowie ein Licht, das sich auf Gesamtkosten von ~ $ 170 summieren sollte, die den vorherigen Methoden folgen und diese erweitern44.
Haltebecher: Obwohl Plastikbecher zum Sortieren und Halten des behandelten Exemplars verwendet werden, wären mit Wachs ausgekleidete Pappbecher oder Glasbehälter geeignete Alternativen.
Veränderung des Organismus und des Lebensstadiums:
Diese Methode ist sehr anpassungsfähig für die Verwendung mit anderen Vektoren, Insekten und / oder Arthropoden wie Culex quinquefasciatus Moskitos 32, Hausfliegen32 und Kakerlaken 45, sowie nicht erwachsene Lebensstadien, wie Mückenlarven 46.
Aktuelle Änderung des Applikationsstandorts:
Diese Methode beschreibt die Anwendung des Insektizids auf den ventralen Thorax und die Bauchregion für Moskitos (und den Dorsum für Fruchtfliegen). Andere Anwendungsorte können jedoch verwendet werden, solange die Belichtungsstelle konsistent ist. Konsistenz ist wichtig, da die Insektizidempfindlichkeit je nach Anwendungsortvariieren kann 32.
Ratschläge zur Fehlerbehebung: Diese Methode besteht aus mehreren Schritten, die zunächst eine Herausforderung darstellen. Im Folgenden werden einige der häufigsten Probleme beschrieben, auf die man stoßen kann.
Undichte / verdampfende Insektizidlösungen:
Insektizide werden üblicherweise in Aceton, einer hochflüchtigen Verbindung, gelöst. Dies bedeutet, dass Aceton bei Raumtemperatur schnell verdunstet und die Insektizidkonzentrationen im Laufe der Zeit erhöht. Wenn die Insektizidlösungen undicht zu sein scheinen oder verdampfen, stellen Sie die Lösungen neu her, stellen Sie sicher, dass der Deckel des Röhrchens fest sitzt, und überprüfen Sie, ob die Speicherprotokolle ordnungsgemäß befolgt werden (z. B. wird Parafilm verwendet und die Röhrchen werden aufrecht gelagert). Wenn die Leckage anhält, versuchen Sie, die Röhrchen mit einem niedrigeren Volumen zu füllen, um mehr Raum für die Änderung des Volumens zu lassen, die das Aceton bei verschiedenen Temperaturen erfährt. Wenn Sie Aceton als Lösungsmittel verwenden, stellen Sie außerdem sicher, dass die Röhrchen für die Acetonlagerung ausgelegt sind (z. B. FEP-, TFE- und PFA-Kunststoffe). Wenn Sie hydrophobe Insektizide verwenden, lagern Sie die Lösungen in Glasfläschchen (da hydrophobe Insektizide weniger als Kunststoff an Glas haften). Es ist auch eine gute Praxis, den Meniskus der Lösung vor der Lagerung zu markieren, um die Verdunstung zu überwachen.
Gewichtsdriften auf der Mikrowaage beim Wiegen von Organismen:
Wenn der Gewichtswert auf der Waage driftet (langsam nach oben oder unten), könnte dies auf statische Werte zurückzuführen sein. Drift tritt am häufigsten beim Wiegen von Organismen in Kunststoffgegenständen auf, da Kunststoff leicht eine statische Ladung halten kann. Um dies zu vermeiden, kann ein Wiegepapier unter den zu wiegenden Kunststoffbehälter gelegt oder ein Nicht-Kunststoffbehälter wie Glas verwendet werden.
Abnormale Mortalitätsergebnisse:
Es gibt viele Möglichkeiten, wie die Mortalitätsergebnisse abnormal erscheinen können, wie z.B. die Beobachtung einer hohen Mortalität in den Kontrollen oder einer hohen/niedrigen Mortalität bei allen Insektiziddosen. Überprüfen Sie die folgenden Fälle zur Problembehandlung in den einzelnen Szenarien.
Hohe Kontrollmortalität
Wenn in der Kontrollgruppe eine hohe Mortalität (10% oder mehr) vorliegt, bewerten Sie die Knockdown-Methode und die Zeitspanne, in der die Proben niedergeschlagen werden. Wenn möglich, verkürzen Sie die Zeitspanne, für die die Proben niedergeschlagen werden. Andere mögliche Faktoren, die für eine hohe Mortalität in den Kontrollen zu berücksichtigen sind, sind i) die Überprüfung, ob die Inkubatoreinstellungen korrekt sind – abnormale Temperaturen und / oder Feuchtigkeit könnten zu einer erhöhten Mortalität führen. Temperatur und Luftfeuchtigkeit sollten mit einem unabhängigen Datenlogger überprüft werden. ii) Beurteilung des Umgangs mit Insekten. Der Umgang mit Insekten zu viel oder zu grob könnte zu einer hohen Sterblichkeit führen. iii) Überprüfung, ob keine Insektizidkontamination in dem 100% Aceton vorhanden ist, das zur Behandlung der Kontrollgruppe oder auf der Instrumentierung verwendet wird. Ersetzen Sie Aceton und reinigen Sie alle Instrumente mit Aceton oder Ethanol. Vermeiden Sie Verunreinigungen, indem Sie häufig Handschuhe austauschen, das Verschütten verhindern und die Instrumente reinigen. Beachten Sie, dass in der Zusatzdatei 3 maximal zwei Moskitos in den Kontrollbechern (nur Aceton) gestorben sind. Diese Sterblichkeitsrate wird nicht als hoch angesehen (sie beträgt weniger als 10%), und daher gab es keinen Grund zur Besorgnis.
Hohe Mortalität in allen exponierten Gruppen (aber nicht in Kontrollgruppen)
Verwenden Sie niedrigere Insektizidkonzentrationen oder kleinere Dosisvolumina zum Testen. Die verwendeten Dosierungen können über der Mindestdosis liegen, die keine Mortalität induziert. Verwenden Sie mehrere 10-fache Verdünnungen, um den richtigen Dosisbereich zu identifizieren und eine Kontamination auszuschließen. Um eine Kontamination zu vermeiden, beginnen Sie mit der Dosierung mit der niedrigsten Konzentration und arbeiten Sie auf die höchste Konzentration hin. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle verwendeten Geräte regelmäßig mit Aceton und / oder Ethanol gereinigt werden, die auf die Probe aufgetragenen Dosen sehr gering sind und selbst die geringste Kreuzkontamination die Ergebnisse beeinträchtigen kann.
Niedrige Mortalität in allen exponierten Gruppen
Verwenden Sie höhere Insektizidkonzentrationen. Die verwendeten Dosierungen könnten alle zu niedrig sein, um die Mortalität in der Bevölkerung zu verursachen. Um den richtigen Dosisbereich zu identifizieren, setzen Sie die Proben mehreren weiteren 10-fachen konzentrierten Dosierungen aus. Stellen Sie sicher, dass die Insektizidlösungen nicht abgelaufen oder abgebaut sind (möglicherweise aufgrund hoher Temperaturen oder Lichteinwirkung). Wenn die Lösungen abgelaufen sind oder der Verdacht besteht, dass sie sich verschlechtert haben, erstellen Sie die Lösungen neu und stellen Sie sicher, dass die richtigen Lagerbedingungen eingehalten werden.
Inkonsistente Mortalität zwischen Replikationen/Tagen
Die Tageszeit, zu der Insekten dem Insektizid ausgesetzt sind, könnte den Grad der zum Ausdruck gebrachten Resistenz beeinflussen, insbesondere bei metabolischen Resistenzen34. Wiederholen Sie dieses Protokoll jeden Tag während des gleichen Zeitfensters, um die Tageszeit als potenzielle Variable zu vermeiden, die zu Änderungen der Mortalität beiträgt. Andere mögliche Faktoren, die zu einer inkonsistenten Mortalität zwischen Replikaten beitragen, sind i) Proben, die zwischen den Experimenten unterschiedlich aufgezogen werden. Stellen Sie sicher, dass alle Exemplare die gleiche Altersgruppe haben, bei der gleichen Temperatur und ähnlichen Dichten und Nahrungsverfügbarkeit aufgezogen werden. ii) Insektizidkonzentrationen, die im Laufe der Zeit abgebaut werden oder sich aufgrund der Acetonverdunstung konzentrieren. Überarbeiten Sie die Lösungen und stellen Sie die richtigen Lagerbedingungen sicher. iii) Inkonsistente Mortalitätsbewertung. Stellen Sie sicher, dass dieselbe Person die Mortalität bewertet, oder entwickeln Sie ein klares Protokoll, das im gesamten Team konsistent verwendet werden kann. Verwenden Sie Blind-Scoring, um Verzerrungen bei der Mortalitätsbewertung zu reduzieren.
Insekten, die an der Oberfläche der Sortierschale haften:
Aceton reagiert auf Kunststoffe, die in diesem Protokoll verwendet werden, wie Petrischale. Die Probe haftet wahrscheinlich an der Oberfläche, wenn Aceton auf Petrischalen oder ähnlichen Kunststoffoberflächen verwendet wird. Diese Haftung kann vermieden werden, indem das Sortierfach mit Wiegepapier ausgekleidet oder ein sortierfach ohne Kunststoff verwendet wird. Darüber hinaus kann Kondensation auf der Oberfläche von Kunststoff in der Sortierschale oder in den Haltebechern dazu führen, dass Insekten an der Kondensation haften, oder die Probe kann zu kalt sein und möglicherweise an der Oberfläche gefrieren. Passen Sie die Knockdown-Methode an, um die Kondensation zu reduzieren und gleichzeitig zu verhindern, dass die Proben zu kalt / gefroren werden (z. B. Wägepapier zwischen die Proben und das Kunststoffsortierfach legen).
R-Analysefehler:
Sobald die Mortalitätsdaten gesammelt wurden, können während der Analyse eine Vielzahl von Komplikationen auftreten. Der häufigste Grund, warum ein R-Code die Aktionen für die Datendatei nicht ausführen kann, ist, dass das Datenformat nicht mit dem Code übereinstimmt (z. B. Spaltenüberschriften und/oder leere Zellen). Wenn schwerwiegendere Komplikationen auftreten, lesen Sie die R-Hilfeseiten, die in Rstudio35 integriert sind.
Einschränkungen der oben beschriebenen topischen Anwendungsmethode:
Die Insektizidabsorption über die topische Anwendungsmethode ahmt keine natürliche Exposition nach:
Die topische Anwendung auf den Primärkörper ist nicht die natürliche Art der Insektizidabsorption. Im Feld absorbieren Insekten Insektizide meist über ihre Beine über die Zeit, in der sie mit der mit Insektiziden behandelten Oberfläche oder auf ihren Flügeln durch kleine Aerosolpartikel47,48 in Kontakt kommen, anstatt eine schnelle Exposition auf der ventralen Oberfläche. Die direkte Anwendung einer bekannten Insektiziddosis wird jedoch genau eine phänotypische Reaktion auf Insektizide feststellen, die für genetische und evolutionäre Studien oder Vergleiche der Insektizidempfindlichkeit über Raum oder Zeit hinweg erforderlich ist. Daher ist dieser Ansatz für die Prüfung technischer Resistenzen von Vorteil, misst jedoch nicht direkt die praktische Resistenz (die Wirksamkeit des tatsächlichen Interventionsinstruments in einer Feldeinstellung15). Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die derzeitigen Standardmethoden (z. B. WHO-Röhrchentests und CDC-Flaschenbioassays) auch keine Insektizidexposition im Feld erfassen oder nachahmen können (d. H. Durch Beschlagen).
Topische Applikationsassays können nur Kontaktabsorptionsinsektizide beurteilen:
Diese Methode ist für Insektizide vorgesehen, die durch Kontakt und Absorption des Insektizids wirken, und nicht für die Verwendung mit oralen Insektiziden, wie Borsäure, die üblicherweise in attraktiven toxischen Zuckerködern verwendetwird 49.
Bedeutung der Methode:
Die topische Applikationsmethode erweitert etablierte Standards für Insektizid-Bioassays durch Berechnung der tödlichen Dosis (nicht Konzentration) und Messung der technischen (nicht praktikablen) Resistenz15. Im Folgenden sind die Vor- und Nachteile dieser Methode gegenüber bestehenden Insektizid-Suszeptibilitätstests aufgeführt.
Berechnung der tödlichen Dosis:
Diese Methode bestimmt die tödliche Dosis des Insektizids und nicht die tödliche Konzentration, die die CDC- und WHO-Bioassays zur Bestimmung der diskriminierenden Dosis11 verwenden. Die tödliche Dosis ist aussagekräftiger, da es sich um eine quantifizierte Menge an Insektizid handelt, von der bekannt ist, dass sie die Mortalität auslöst. Im Gegensatz dazu berücksichtigt die tödliche Konzentration nicht, wie viel Insektizid der Organismus tatsächlich erwirbt. Bei der Berechnung der tödlichen Dosis können Unterschiede zwischen geschlechts- oder größenabhängigen Suszeptibilitätsprofilen genauer beobachtet und quantifiziert werden, was diese Messung noch vielseitiger macht.
Technische Beständigkeit:
Diese Methode bewertet die technische Beständigkeit, d. h. den Widerstand, der in standardisierten, kontrollierten Umgebungen gemessen wird. Solche Messungen eignen sich zur Überwachung der Ausbreitung von Insektizidresistenzen und zur Verknüpfung phänotypischer Resistenzen mit potenziellen Markern15. Aufgrund der verringerten Variation der Mortalität aufgrund des Bioassays zur topischen Anwendung ermöglicht es eine bessere Identifizierung neuer Resistenzmarker. Aufgrund der unnatürlichen Exposition von Insektiziden gegenüber der Mücke ist dieser Assay jedoch nicht für die Abschätzung der Wirksamkeit eines bestimmten Eingriffs in einer bestimmten Population geeignet. Für Messungen eines solchen praktischen Widerstands werden weitere Assays benötigt15.
Anpassungsfähigkeit der Proben:
Diese Methode kann an anderen wichtigen Arthropoden wie Pflanzenschädlingen (z. B. Kartoffelkäfer), Hausschädlingen (z. B. Kakerlaken und Bettwanzen) oder Bestäubern (z. B. Bienen) mit einfachen Änderungen des Knockdown-Ansatzes und / oder der Insektiziddosis, des Volumens und / oder der Konzentration (wie oben beschrieben) angewendet werden. Die einfache Anpassungsfähigkeit kann dazu beitragen, die Insektizidresistenzforschung in verschiedenen Forschungsbereichen zu analogisieren. Die Verwendung eines LD 50-Wertes anstelle einer tödlichen Konzentration, die 50% der Exemplare tötet (LC50), ermöglicht einen genauen Vergleich zwischen den Arten.
Kosten:
Ähnlich wie bei CDC-Flaschenbioassays und WHO-Röhrchentests sind die Kosten für die Durchführung des topischen Anwendungstests minimal (siehe Materialtabelle). Die wesentlichen Ausrüstungsgegenstände sind die Spritze (ca. 70 US-Dollar) und der Spender (ca. 100 US-Dollar), die über Assays wiederverwendbar sind.
Anzahl der benötigten Exemplare:
Pro topischem Applikationsassay-Becher sollten mindestens 20-25 Proben verwendet werden. Es wird empfohlen, mindestens fünf Insektizidkonzentrationen pro Experiment zu testen, wobei mindestens drei Replikate für das Verfahren empfohlen werden. Insgesamt ergeben sich daraus mindestens 300-375 Proben, die für einen vollständigen Test benötigt werden, vergleichbar mit der Anzahl der Proben, die für die Durchführung von Widerstandsintensitätstests mit WHO-Röhrchentests oder CDC-Flaschenbioassays erforderlich sind. Wenn jedoch mit dem topischen Anwendungsbioassay eine reduzierte Variabilität erreicht wird, kann die gleiche Anzahl von Proben zu mehr statistischer Aussagekraft führen, um Suszeptibilitätsdaten über Raum oder Zeit hinweg zu vergleichen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch einen CAREER-Preis der National Science Foundation an SH unter der Preisnummer 2047572 unterstützt. Wir danken Damien Rivera für seine Unterstützung bei der Aufzucht von Fruchtfliegen und der Vorbereitung auf den topischen Anwendungsassay, Dr. Ganetzky von der University of Wisconsin-Madison für die gemeinsame Nutzung seiner Canton-S-Fruchtfliegensorte, den Centers for Disease Control and Prevention für die gemeinsame Nutzung des Rockefeller-Stammes und dem United States Department of Agriculture Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology für die gemeinsame Nutzung des IICC-Isoline-Stammes. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T., Roush, R. T., Tabashnik, B. E. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
