Biotest di applicazione topica per quantificare la tossicità degli insetticidi per zanzare e moscerini della frutta
Summary
Descriviamo la metodologia e l’importanza del biotest di applicazione topica per misurare la suscettibilità agli insetticidi nelle zanzare e nei moscerini della frutta. Il test presentato è ad alto rendimento, utilizza la massa degli insetti, consentendo così di calcolare una dose letale relativizzata alla massa anziché la concentrazione, e probabilmente ha una variabilità inferiore rispetto ad altri metodi simili.
Abstract
L’uso continuato di insetticidi per la salute pubblica e l’agricoltura ha portato a una diffusa resistenza agli insetticidi e all’ostacolo dei metodi di controllo. La sorveglianza della resistenza agli insetticidi delle popolazioni di zanzare viene in genere effettuata attraverso i test biologici delle bottiglie dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC) o i test su sondi dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Tuttavia, questi metodi possono comportare un alto grado di variabilità nei dati di mortalità a causa del contatto variabile dell’insetticida con l’insetto, del numero relativamente piccolo di organismi testati, dell’ampia variazione di massa tra le popolazioni e delle condizioni ambientali in costante cambiamento, portando a risultati variabili. Questo documento presenta il biotest di applicazione topica, adattato come biotest fenotipico ad alto rendimento sia per le zanzare che per i moscerini della frutta, per testare un gran numero di insetti lungo una gamma di concentrazioni di insetticidi.
Questo saggio 1) garantisce un trattamento coerente e il contatto insetticida con ogni organismo, 2) produce curve dose-risposta altamente specifiche che tengono conto delle differenze di massa media tra ceppi e sessi (che è particolarmente importante per gli organismi raccolti sul campo) e 3) consente il calcolo di dosi letali mediane statisticamente rigorose (LD50 ), che sono necessari per il confronto del rapporto di resistenza: un approccio di sorveglianza alternativo dalla mortalità diagnostica della dose, che viene utilizzato anche per la sorveglianza della resistenza ai larvicidi. Questo test sarà uno strumento complementare per fenotipizzare accuratamente le popolazioni di zanzare e, come illustrato utilizzando moscerini della frutta, è facilmente adattabile per l’uso con altri insetti. Sosteniamo che questo test aiuterà a colmare il divario tra resistenza agli insetticidi genotipica e fenotipica in più specie di insetti.
Introduction
Le zanzare sono responsabili di oltre 700.000 morti ogni anno a causa delle malattie che trasmettono agli esseri umani, con oltre la metà di quelle morti dovute alla sola malaria1. Il principale metodo preventivo contro la trasmissione della malaria e di altre malattie trasmesse da vettori è l’uso di insetticidi, spesso sotto forma di reti insetticide di lunga durata o irrorazione residua interna2. Tuttavia, la resistenza agli insetticidi è diffusa tra le zanzare e altri insetti vettori, così come i parassiti agricoli 3,4. Per gestire efficacemente la resistenza, la sorveglianza è di fondamentale importanza5. Per questo, sono necessari metodi di rilevamento della resistenza altamente accurati e ad alta produttività. Attualmente, gli strumenti di sorveglianza della resistenza agli insetticidi più diffusi per le zanzare sono il test del tubo dell’OMS6 e il biotest della bottiglia del CDC7. Per i moscerini della frutta il metodo di applicazione del contatto residuo (simile al biotest della bottiglia CDC) è un biodosaggio insetticida comunemente usato 8,9,10. Tuttavia, la variabilità nei dati di questi metodi è in genere elevata, con misurazioni dello stesso ceppo di zanzara di laboratorio che vanno da ~ 20-70% di mortalità nei saggi di bottiglia CDC e 0-50% nei test in prove in prove dell’OMS quando esposti a dosaggi subletali11. Tale variazione è sorprendente perché la limitata variazione genetica nella maggior parte dei ceppi di laboratorio dovrebbe portare a una limitata variazione della suscettibilità agli insetticidi nella popolazione. Tuttavia, c’è ancora un alto livello di variazione osservato nei risultati del biotest.
Le potenziali fonti di questa variazione potrebbero essere il risultato di un’esposizione eterogenea agli insetticidi tra campioni all’interno del biotest a causa dell’esposizione indiretta agli insetticidi attraverso la superficie, degli effetti ambientali eterogenei, della normale variazione biologica tra individui dello stesso genotipo e della variazione della massa di campioni della stessa popolazione12 . Un metodo usato raramente con una replicabilità più elevata è il biotest di applicazione topica. In questo test, l’insetticida viene applicato direttamente a ciascun insetto13,14, rimuovendo il fattore di esposizione eterogenea di diversi campioni all’interno dello stesso test. Tuttavia, a causa della natura a lenta produttività di questo metodo, non viene utilizzato abitualmente come strumento di sorveglianza della suscettibilità agli insetticidi per le popolazioni di zanzare. Questo documento presenta un protocollo modificato per il biotest di applicazione topica che consente esposizioni a più alto rendimento, correggendo anche la variazione della massa degli insetti, un parametro correlato ai cambiamenti nella suscettibilità agli insetticidi12. Una riduzione del rumore e della variazione associata alla massa dei dati di mortalità da esposizione variabile agli insetticidi consentirebbe una sorveglianza tecnica della resistenza più accurata11,15. Tali dati potrebbero essere utilizzati per associare più accuratamente la resistenza fenotipica con marcatori genetici, parametri di fitness e/o competenza vettoriale. Inoltre, dimostriamo come questo test potrebbe essere facilmente adattato ad altre specie di insetti utilizzando il biotest di applicazione topica sui moscerini della frutta, una specie di insetti di corpo più piccolo.
Il limite principale delle suddette applicazioni di contatto residuo è che l’esposizione agli insetticidi può variare da campione a campione all’interno dello stesso test. Nel caso dei biosaggi delle bottiglie CDC e del metodo di contatto, l’esposizione agli insetticidi può variare tra le repliche dello stesso test. Gli insetti sono esposti a insetticidi che vengono distribuiti all’interno di una bottiglia di vetro (cdc bottle bioassay e metodo di contatto) o su carte impregnate (test della sonda dell’OMS). La concentrazione di insetticida su entrambe le superfici (vetro e carta) è nota e predeterminata mediante lo screening di diverse specie di genotipi noti. Tuttavia, la quantità disponibile per essere potenzialmente assorbita dall’insetto può variare notevolmente a seconda della superficie utilizzata, dei componenti della miscela di insetticidi e di quanto omogeneamente l’insetticida è distribuito sul materiale superficiale16,17. Nel biotest della bottiglia CDC, il rivestimento insetticida all’interno della bottiglia dipende dalle procedure utilizzate da ciascun laboratorio e utente. Nel test su provetta dell’OMS, le carte trattate con insetticida sono prodotte centralmente e quindi molto probabilmente abbastanza omogenee tra i laboratori. Tuttavia, nel test della sonda dell’OMS, il tubo di esposizione consente ai campioni di atterrare e riposare su reti metalliche non esposte a insetticidi, portando a una potenziale esposizione eterogenea agli insetticidi tra i campioni all’interno di ciascun test. La quantità effettiva di insetticida raccolto e assorbito dai campioni attraverso ciascun metodo deve ancora essere esplorata ulteriormente18.
Inoltre, il biotest della bottiglia CDC, il test della sonda dell’OMS e il metodo di contatto sono più comunemente usati come saggi di soglia che testano solo una concentrazione di insetticida predeterminata. Questo approccio può rilevare con precisione la presenza di resistenza ed è prezioso per la sorveglianza della resistenza (specialmente quando la resistenza si sta diffondendo). Tuttavia, i saggi di soglia non possono quantificare la forza della resistenza, che potrebbe essere più predittiva dell’efficacia degli strumenti di intervento. Se vengono utilizzate più concentrazioni di insetticidi con questi metodi, possono essere utilizzate come saggi di intensità. I saggi di intensità per il biosasaggio della bottiglia CDC e il test della sonda dell’OMS sono stati introdotti testando 5x e 10 volte i dosaggi discriminanti predeterminati per affrontare questa lacuna nella sorveglianza 6,19. Pur fornendo una maggiore capacità di distinguere tra popolazioni resistenti, 3-5 dosaggi (predeterminati) forniscono una risoluzione limitata per calcolare le concentrazioni letali. Inoltre, zanzare di varie dimensioni sono utilizzate in tali test. Tuttavia, la massa è importante da misurare in quanto i campioni più grandi potrebbero aver bisogno di una dose più elevata per essere uccisi poiché la dose efficace per unità di massa sarà molto inferiore a quella di un organismo più piccolo12. Il calcolo di una dose letale relativizzata di massa (quantità di insetticida per massa di insetto) sarebbe una metrica più utile rispetto alla più comune concentrazione letale (ad esempio, quantità di insetticida per superficie) in quanto considera la variazione della massa degli insetti tra sessi, popolazioni e genotipi. Tali dati contribuirebbero a colmare il divario tra resistenza genotipica e fenotipica all’interno del laboratorio e del campo e potrebbero anche fornire un modo semplice per calcolare la concentrazione di applicazione necessaria per trattare una popolazione di insetti di massa media nota.
L’uso di dosaggi letali relativizzati alla massa che uccidono il 50% dei campioni (LD50) incorpora anche molti altri benefici. La valutazione della tossicità di un composto specifico in mg/kg (= ng/mg) è standard nella tossicologia umana e veterinaria14 e i valori di DL50 si trovano nelle schede di sicurezza dei materiali. I dosaggi letali consentono anche il confronto diretto della tossicità tra diverse sostanze chimiche verso una particolare specie o la stessa sostanza chimica verso diverse specie20, nonché una valutazione di alta qualità di nuovi insetticidi e sostanze chimiche13. Inoltre, la LD50 può fornire rapporti di resistenza più significativi e accurati rispetto a quelli derivati dai risultati diagnostici di mortalità della dose, che possono comportare una sovrastima del livello di resistenza presente in una popolazione. Pertanto, questo test sarebbe adatto per i programmi di sorveglianza di routine fornendo un monitoraggio della resistenza più rigoroso basato su dosi letali relativizzate alla massa derivate da più campioni di quanto raccomandato per altri saggi biologici21.
Il metodo di applicazione topica è stato utilizzato nella sorveglianza della suscettibilità agli insetticidi per zanzare e mosche come alternativa ai biotest standard di suscettibilità agli insetticidi quando la resistenza è già nota o sospetta22,23, nonché per la sorveglianza in alcuni insetti nocivi24 per valutare più accuratamente i profili di resistenza e la tossicità intrinseca degli insetticidi21 . Nei biosaggi di applicazione topica, l’insetticida viene applicato a ciascun organismo, con conseguente variazione minima nell’esposizione all’insetticida. Questo documento presenta un metodo leggermente adattato e migliorato che consente di applicare l’esposizione agli insetticidi a un gran numero di insetti in un breve periodo, controllando anche la massa degli insetti22. Questo metodo a più alto rendimento con buoni livelli di replicabilità potrebbe essere un utile strumento aggiuntivo per la sorveglianza di routine della suscettibilità agli insetticidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento presenta un protocollo adattato per il test di applicazione topica per zanzare e moscerini della frutta. Questa procedura potrebbe essere facilmente adattata per essere utilizzata sul campo e con altri organismi in quanto richiede attrezzature specializzate minime. Di seguito sono riportati i passaggi critici di questo protocollo, le potenziali modifiche, i consigli per la risoluzione dei problemi, le limitazioni del metodo e il significato di questo metodo.
Passaggi critici nel protocollo: Ci sono tre passaggi critici nel protocollo che, se completati in modo errato, possono avere un impatto drastico sui risultati del biotest: accuratezza della concentrazione di insetticidi, abbattimento del campione e valutazione della mortalità.
Precisione della concentrazione di insetticida:
È estremamente importante disporre di soluzioni insetticide accurate per ottenere curve dose-risposta replicabili e risultati significativi. L’approccio volumetrico alla preparazione della soluzione insetticida è più comune in letteratura sia per il biodosaggio7 del flacone CDC che per le applicazioni topiche 13,14,43. Tuttavia, l’approccio gravimetrico qui descritto è intrinsecamente più accurato a causa della considerazione della temperatura attraverso l’inclusione della densità (specifica della temperatura), portando a una preparazione della formulazione più accurata.
Abbattimento del campione:
Abbattere i campioni è una componente critica di questo metodo e consente la somministrazione accurata dell’insetticida e le misurazioni del peso. Tuttavia, abbattere gli organismi contiene inevitabilmente il rischio di stress fisico e danni, come precedentemente dimostrato30. Pertanto, sii cauto e consapevole quando abbatti i campioni per assicurarti che i) ogni campione venga abbattuto per una durata simile, ii) la durata dell’abbattimento sia ridotta al minimo e iii) il metodo di abbattimento sia mantenuto coerente tra tutti gli esemplari. Inoltre, si consiglia di testare il metodo di abbattimento separatamente, prima dell’applicazione dell’insetticida, per assicurarsi che il metodo abbia successo e non induca una mortalità di controllo superiore al 10%. Il test iniziale potrebbe richiedere più tempo per un utente inesperto, portando a tempi di knockdown più lunghi. Pertanto, sii cauto quando interpreti i risultati dei primi test.
Valutazione della mortalità:
Valutare la mortalità può essere difficile, specialmente quando l’insetticida non uccide completamente ma solo abbatte o mutila la zanzara o la mosca. Pertanto, è importante essere consapevoli di come l’insetticida influisce sull’organismo bersaglio e avere una chiara definizione di organismi “morti” (o abbattuti) prima di iniziare. Inoltre, si raccomanda che la stessa persona valuti la mortalità tra le dosi e si replichi per ridurre la variazione.
Modifiche del protocollo: Diverse modifiche descritte di seguito possono essere applicate a questo protocollo per migliorarne la versatilità e l’accessibilità.
Adattamento del test a insetti di dimensioni più piccole o maggiori:
Quando si utilizzano campioni più piccoli o più grandi, si consiglia di applicare rispettivamente un volume di dose più piccolo o maggiore di insetticida. Ad esempio, abbiamo adattato il protocollo delle zanzare ai moscerini della frutta riducendo la dose di 0,5 μL a una dose di 0,2 μL. Assicurarsi che venga scelta la dimensione corretta della siringa per il volume di dose scelto.
Adattamento del test agli insetti di campo:
Quando si usano gli insetti di campo, potrebbe esserci più variazione nelle dimensioni degli insetti. Pertanto, si raccomanderebbe di pesare gli insetti in gruppi più piccoli (ad esempio, per tazza) invece che come un grande gruppo (ad esempio, tutti gli insetti utilizzati per un esperimento). Questo può aiutare a catturare la potenziale variazione della suscettibilità agli insetticidi associata alle differenze nella massa degli insetti di campo.
Modifiche dell’attrezzatura:
Tenda per la manipolazione degli insetti: il dosaggio del campione può essere completato sotto una tenda per la manipolazione degli insetti che è semplicemente costruita con tubo in PVC e zanzariera. Questa può essere un’alternativa a una stanza chiusa (ad esempio, insetticida) e aiutare a eliminare la potenziale contaminazione da insetticidi nelle aree in cui potrebbe verificarsi l’allevamento di insetti. Questa tenda per la gestione degli insetti è facile da costruire e a basso costo (~ $ 70). In alternativa, è possibile acquistare una gabbia per la gestione degli insetti (~ $ 425).
Tavolo freddo: impacchi di ghiaccio o vassoi di ghiaccio possono essere utilizzati per abbattere il campione e / o mantenere il campione abbattuto.
Incubatore: gli incubatori sono raccomandati per allevare il campione e tenere il campione per 24 ore dopo il trattamento insetticida. Se un incubatore non è disponibile, può essere costruito. Le attrezzature necessarie per costruire l’incubatore includono un contenitore isolato, umidificatore, cavi termici, regolatore di umidità e temperatura e una luce, che dovrebbe ammontare a un costo totale di ~ $ 170, seguendo ed espandendo i metodi precedenti44.
Bicchieri di tenuta: Sebbene i bicchieri di plastica siano usati per ordinare e contenere il campione trattato, i bicchieri di carta rivestiti di cera o i contenitori di vetro sarebbero alternative adatte.
Modifica dell’organismo e dello stadio di vita:
Questo metodo è molto adattabile per l’uso con altri vettori, insetti e / o artropodi come le zanzare Culex quinquefasciatus 32, le mosche domestiche32 e gli scarafaggi45, così come le fasi della vita non adulta, come le larve di zanzara46.
Modifica della posizione dell’applicazione topica:
Questo metodo descrive l’applicazione dell’insetticida al torace ventrale e alla regione dell’addome per le zanzare (e il dorso per i moscerini della frutta). Tuttavia, è possibile utilizzare altre posizioni dell’applicazione purché il sito di esposizione sia coerente. La coerenza è importante perché la sensibilità agli insetticidi può variare in base alla posizione di applicazione32.
Consigli per la risoluzione dei problemi: Questo metodo ha diversi passaggi che sono inizialmente impegnativi. Di seguito sono descritti alcuni dei problemi più comuni che si potrebbero incontrare.
Soluzioni insetticide che perdono/evaporano:
Gli insetticidi sono comunemente disciolti nell’acetone, un composto altamente volatile. Ciò significa che l’acetone evapora rapidamente a temperatura ambiente, aumentando le concentrazioni di insetticida nel tempo. Se le soluzioni insetticide sembrano perdere o evaporare, rifare le soluzioni, assicurarsi che il coperchio del tubo sia ben acceso e ricontrollare che i protocolli di conservazione vengano seguiti correttamente (ad esempio, viene utilizzato il parafilm e i tubi vengono conservati in posizione verticale). Se la perdita persiste, prova a riempire i tubi con un volume inferiore per consentire più spazio per la variazione di volume che l’acetone sperimenta a temperature diverse. Inoltre, se si utilizza l’acetone come solvente, assicurarsi che i tubi siano classificati per lo stoccaggio dell’acetone (ad esempio, plastica FEP, TFE e PFA). Se si utilizzano insetticidi idrofobici, conservare le soluzioni in flaconcini di vetro (poiché gli insetticidi idrofobici aderiscono al vetro meno della plastica). È anche buona norma contrassegnare il menisco della soluzione prima della conservazione per monitorare l’evaporazione.
Peso alla deriva sulla microbilancia durante la pesatura degli organismi:
Se la lettura del peso sulla bilancia è alla deriva (salendo o scendendo lentamente), ciò potrebbe essere dovuto alla statica. La deriva si verifica più spesso quando si pesano organismi in oggetti di plastica, poiché la plastica può facilmente trattenere una carica statica. Per evitare ciò, è possibile posizionare una carta da pesare sotto il contenitore di plastica da pesare o utilizzare un contenitore non di plastica come il vetro.
Risultati anomali della mortalità:
Ci sono molti modi in cui i risultati della mortalità possono sembrare anormali, come osservare un’alta mortalità nei controlli o un’alta / bassa mortalità in tutte le dosi di insetticida. Esaminare i casi seguenti per la risoluzione dei problemi relativi a ogni scenario.
Elevata mortalità per il controllo
Se c’è un’alta mortalità nel gruppo di controllo (10% o superiore), valutare il metodo di abbattimento e il periodo di tempo in cui i campioni vengono abbattuti. Se possibile, abbreviare il periodo di tempo per il quale i campioni vengono abbattuti. Altri potenziali fattori da considerare per un’elevata mortalità nei controlli includono i) verificare se le impostazioni dell’incubatore sono corrette: temperature e / o umidità anormali potrebbero portare ad un aumento della mortalità. La temperatura e l’umidità devono essere controllate con un data logger indipendente. ii) Valutazione della manipolazione degli insetti. Maneggiare gli insetti troppo o troppo approssimativamente potrebbe portare ad un’alta mortalità. iii) Verificare se non vi è contaminazione da insetticida nel 100% acetone utilizzato per trattare il gruppo di controllo o sulla strumentazione. Sostituire l’acetone e pulire tutti gli strumenti con acetone o etanolo. Evitare la contaminazione sostituendo frequentemente i guanti, prevenendo fuoriuscite e pulendo gli strumenti. Si noti che nel file supplementare 3, un massimo di due zanzare sono morte all’interno delle tazze di controllo (solo acetone). Questo livello di mortalità non è considerato elevato (è inferiore al 10%) e quindi non c’era motivo di preoccupazione.
Alta mortalità in tutti i gruppi esposti (ma non nei gruppi di controllo)
Utilizzare concentrazioni di insetticidi più basse o volumi di dose più piccoli per i test. I dosaggi utilizzati potrebbero essere superiori alla dose minima che non indurrà la mortalità. Utilizzare diverse diluizioni 10 volte per identificare l’intervallo di dosaggio corretto ed escludere la contaminazione. Per evitare la contaminazione, iniziare a dosare con la concentrazione più bassa e lavorare verso la massima concentrazione. Inoltre, assicurarsi che tutte le apparecchiature utilizzate siano regolarmente pulite con acetone e / o etanolo, che le dosi applicate al campione siano molto piccole e che anche la minima contaminazione incrociata possa influire sui risultati.
Bassa mortalità in tutti i gruppi esposti
Utilizzare concentrazioni di insetticidi più elevate. I dosaggi utilizzati potrebbero essere tutti troppo bassi per causare mortalità nella popolazione. Per identificare l’intervallo di dosaggio corretto, esporre i campioni a diversi dosaggi concentrati 10 volte. Assicurarsi che le soluzioni insetticide non siano scadute o degradate (potenzialmente a causa di alte temperature o esposizione alla luce). Se le soluzioni sono scadute o si sospetta che si siano degradate, rifare le soluzioni e garantire che vengano seguite le condizioni di conservazione adeguate.
Mortalità incoerente tra repliche/giorni
Il momento della giornata in cui gli insetti sono esposti all’insetticida potrebbe influenzare il livello di resistenza espresso, in particolare per la resistenza metabolica34. Ripeti questo protocollo durante la stessa finestra di tempo ogni giorno per evitare che l’ora del giorno sia una potenziale variabile che contribuisce ai cambiamenti nella mortalità. Altri potenziali fattori che contribuiscono alla mortalità incoerente tra le repliche includono i) campioni allevati in modo differenziale tra gli esperimenti. Assicurarsi che tutti gli esemplari siano della stessa fascia di età, allevati alla stessa temperatura e densità e disponibilità di cibo simili. ii) concentrazioni di insetticidi che si degradano nel tempo o diventano più concentrate a causa dell’evaporazione dell’acetone. Rifare le soluzioni e garantire condizioni di conservazione adeguate. iii) Punteggio di mortalità incoerente. Assicurarsi che la stessa persona segni la mortalità o sviluppare un protocollo chiaro da utilizzare in modo coerente in tutto il team. Usa il punteggio cieco per ridurre i pregiudizi nel punteggio di mortalità.
Insetti che si attaccano alla superficie del vassoio di smistamento:
L’acetone reagisce alle materie plastiche utilizzate in questo protocollo, come le piastre di Petri. Il campione probabilmente aderirà alla superficie se si utilizza acetone su piastre di Petri o superfici di plastica simili. Questa adesione può essere evitata rivestendo il vassoio di selezione con carta da pesatura o utilizzando un vassoio di selezione non in plastica. Inoltre, la condensa sulla superficie della plastica nel vassoio di selezione o nelle tazze di contenimento può portare a insetti che aderiscono alla condensa, oppure il campione può essere troppo freddo e potenzialmente congelare in superficie. Regolare il metodo di abbattimento per ridurre la condensa evitando che i campioni diventino troppo freddi / congelati (ad esempio, posizionare la carta pesata tra i campioni e il vassoio di selezione in plastica).
Errori di analisi R:
Una volta raccolti i dati sulla mortalità, durante l’analisi possono verificarsi una varietà di complicazioni. Il motivo più comune per cui un codice R non può completare le azioni per il file di dati è che il formato dei dati non corrisponde al codice (ad esempio, intestazioni di colonna e/o celle vuote). Se sorgono complicazioni più gravi, fare riferimento alle pagine di aiuto di R integrate in Rstudio35.
Limitazioni del metodo di applicazione topica sopra descritto:
L’assorbimento di insetticidi tramite metodo di applicazione topica non imita l’esposizione naturale:
L’applicazione topica sul corpo primario non è il modo naturale di assorbimento degli insetticidi. Sul campo, gli insetti assorbono principalmente insetticidi attraverso le loro gambe per il periodo di tempo in cui sono in contatto con la superficie trattata con insetticida o sulle loro ali attraverso piccole particelle di aerosol47,48, piuttosto che una rapida esposizione sulla superficie ventrale. Tuttavia, l’applicazione diretta di una dose nota di insetticida stabilirà con precisione una risposta fenotipica agli insetticidi, necessaria per studi genetici ed evolutivi o confronti della suscettibilità agli insetticidi nello spazio o nel tempo. Pertanto, questo approccio è utile per testare la resistenza tecnica, ma non misurerà direttamente la resistenza pratica (l’efficacia dello strumento di intervento effettivo in un ambiente di campo15). Tuttavia, è importante notare che gli attuali metodi standard (ad esempio, test su prove su tubo dell’OMS e biosaggi di bottiglie CDC) non possono catturare o imitare l’aerosol (cioè appannando) l’esposizione agli insetticidi sul campo.
I saggi di applicazione topica possono solo valutare gli insetticidi di assorbimento per contatto:
Questo metodo è destinato agli insetticidi che funzionano attraverso il contatto e l’assorbimento dell’insetticida e non per l’uso con insetticidi orali, come l’acido borico comunemente usato nelle attraenti esche da zucchero tossico49.
Significato del metodo:
Il metodo di applicazione topica espande gli standard consolidati per i biosaggi insetticidi calcolando la dose letale (non concentrazione) e misurando la resistenza tecnica (non pratica)15. Di seguito sono riportati i vantaggi e gli svantaggi di questo metodo rispetto ai saggi di suscettibilità agli insetticidi esistenti.
Calcolo della dose letale:
Questo metodo determina la dose letale dell’insetticida, piuttosto che la concentrazione letale che i biosaggi CDC e OMS usano per stabilire la dose discriminante11. La dose letale è più significativa perché è una quantità quantificata di insetticida nota per suscitare mortalità. Al contrario, la concentrazione letale non considera la quantità di insetticida che l’organismo acquisisce effettivamente. Quando si utilizza il calcolo della dose letale, le differenze tra i profili di suscettibilità dipendenti dal sesso o dalle dimensioni possono essere osservate e quantificate in modo più accurato, rendendo questa misurazione ancora più versatile.
Resistenza tecnica:
Questo metodo valuta la resistenza tecnica, che è la resistenza misurata in ambienti standardizzati e controllati. Tali misurazioni sono adatte per la sorveglianza della diffusione della resistenza agli insetticidi e per collegare la resistenza fenotipica con potenziali marcatori15. A causa della diminuzione della variazione della mortalità derivante dal biotest di applicazione topica, consente una migliore identificazione di nuovi marcatori di resistenza. Tuttavia, a causa dell’esposizione innaturale di insetticidi alla zanzara, questo test non è adatto per la stima dell’efficacia di un intervento specifico in una popolazione specifica. Altri saggi sono necessari per le misurazioni di tale resistenza pratica15.
Adattabilità del campione:
Questo metodo può essere praticato su altri importanti artropodi come parassiti delle colture (ad esempio, coleottero della patata del Colorado), parassiti domestici (ad esempio, scarafaggi e cimici dei letti) o impollinatori (ad esempio, api) con semplici modifiche all’approccio di abbattimento e / o dose di insetticida, volume e / o concentrazione (come descritto sopra). La facilità di adattabilità può aiutare ad analogizzare la ricerca sulla resistenza agli insetticidi in diversi campi di ricerca. L’uso di un valore LD50 invece di una concentrazione letale che uccide il 50% degli esemplari (LC50) consente un confronto accurato tra le specie.
Costo:
Analogamente ai biosaggi delle bottiglie CDC e ai test su provetta dell’OMS, i costi per eseguire il test di applicazione topica sono minimi (vedere la Tabella dei materiali). I pezzi essenziali dell’attrezzatura sono la siringa (circa $ 70) e il distributore (circa $ 100), che sono riutilizzabili attraverso i test.
Numero di esemplari necessari:
Un minimo di 20-25 campioni devono essere utilizzati per tazza di saggio di applicazione topica. Si raccomanda di testare almeno cinque concentrazioni di insetticida per esperimento, con un minimo di tre repliche raccomandate per la procedura. Nel complesso, ciò si traduce in un minimo di 300-375 campioni necessari per un test completo, paragonabile al numero di campioni necessari per eseguire test di intensità di resistenza utilizzando test su prove su sondiera DELL’OMS o biotest di bottiglie CDC. Tuttavia, se si ottiene una ridotta variabilità con il biotest di applicazione topica, lo stesso numero di campioni può portare a una maggiore potenza statistica per confrontare i dati di suscettibilità nello spazio o nel tempo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata da un premio CAREER dalla National Science Foundation a SH con il numero di 2047572. Ringraziamo Damien Rivera per la sua assistenza nell’allevamento di moscerini della frutta e nella preparazione per il test di applicazione topica, il Dr. Ganetzky presso l’Università del Wisconsin-Madison per aver condiviso il suo ceppo di moscerino della frutta Canton-S, i Centers for Disease Control and Prevention per la condivisione del ceppo Rockefeller e il Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology per la condivisione del ceppo isoline IICC. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T., Roush, R. T., Tabashnik, B. E. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
