Essai biologique d’application topique pour quantifier la toxicité des insecticides pour les moustiques et les mouches des fruits
Summary
Nous décrivons la méthodologie et l’importance de l’essai biologique d’application topique pour mesurer la sensibilité aux insecticides chez les moustiques et les mouches des fruits. Le test présenté est à haut débit, utilise la masse d’insectes – permettant ainsi de calculer une dose létale relativisée en masse au lieu de la concentration – et a probablement une variabilité plus faible que d’autres méthodes similaires.
Abstract
L’utilisation continue d’insecticides pour la santé publique et l’agriculture a conduit à une résistance généralisée aux insecticides et à une entrave aux méthodes de lutte. La surveillance de la résistance aux insecticides des populations de moustiques se fait généralement par le biais d’essais biologiques en bouteille des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ou de tests en tube de l’Organisation mondiale de la santé (OMS). Cependant, ces méthodes peuvent entraîner un degré élevé de variabilité des données sur la mortalité en raison du contact variable de l’insecticide avec l’insecte, du nombre relativement faible d’organismes testés, de la variation importante de la masse entre les populations et des conditions environnementales en constante évolution, conduisant à des résultats variables. Cet article présente le bioessai d’application topique, adapté en tant que bioessai phénotypique à haut débit pour les moustiques et les mouches des fruits, pour tester un grand nombre d’insectes le long d’une gamme de concentrations d’insecticides.
Ce test 1) assure un traitement et un contact insecticide cohérents avec chaque organisme, 2) produit des courbes dose-réponse très spécifiques qui tiennent compte des différences de masse moyenne entre les souches et les sexes (ce qui est particulièrement important pour les organismes collectés sur le terrain), et 3) permet le calcul de doses létales médianes statistiquement rigoureuses (DL50 ), qui sont nécessaires pour les comparaisons des rapports de résistance – une approche de surveillance alternative à la mortalité par dose diagnostique, qui est également utilisée pour la surveillance de la résistance aux larvicides. Ce test sera un outil complémentaire pour phénotyper avec précision les populations de moustiques et, comme illustré par les mouches des fruits, est facilement adaptable pour une utilisation avec d’autres insectes. Nous soutenons que ce test aidera à combler l’écart entre la résistance aux insecticides génotypiques et phénotypiques chez plusieurs espèces d’insectes.
Introduction
Les moustiques sont responsables de plus de 700 000 décès chaque année dus aux maladies qu’ils transmettent à l’homme, dont plus de la moitié sont dus au paludismeseulement 1. La principale méthode préventive contre la transmission du paludisme et d’autres maladies à transmission vectorielle est l’utilisation d’insecticides, souvent sous la forme de moustiquaires imprégnées d’insecticide ou de pulvérisations à effet rémanent à l’intérieur2. Cependant, la résistance aux insecticides est répandue chez les moustiques et autres insectes vecteurs, ainsi que chez les ravageurs agricoles 3,4. Pour gérer efficacement la résistance, la surveillance est d’une importance capitale5. Pour cela, des méthodes de détection de résistance très précises et à haut débit sont nécessaires. Actuellement, les outils de surveillance de la résistance aux insecticides les plus répandus pour les moustiques sont le testen tube 6 de l’OMS et le test biologique7 en bouteille du CDC. Pour les mouches des fruits, la méthode d’application par contact résiduel (similaire à l’essai biologique en bouteille du CDC) est un essai biologique insecticide couramment utilisé 8,9,10. Cependant, la variabilité des données de ces méthodes est généralement élevée, avec des mesures de la même souche de moustique de laboratoire allant d’environ 20 à 70% de mortalité dans les tests de bouteille du CDC et de 0 à 50% dans les tests en tube de l’OMS lorsqu’ils sont exposés à des doses sublétales11. Une telle variation est surprenante parce que la variation génétique limitée dans la plupart des souches de laboratoire devrait entraîner une variation limitée de la susceptibilité aux insecticides dans la population. Néanmoins, il y a encore un niveau élevé de variation observée dans les résultats des essais biologiques.
Les sources potentielles de cette variation pourraient être le résultat d’une exposition hétérogène à un insecticide entre les échantillons dans le cadre de l’essai biologique en raison d’une exposition indirecte à l’insecticide par la surface, d’effets environnementaux hétérogènes, d’une variation biologique normale entre des individus du même génotype et d’une variation de la masse des spécimens de la même population12 . Une méthode rarement utilisée avec une reproductibilité plus élevée est le bioessai d’application topique. Dans ce test, l’insecticide est directement appliqué sur chaque insecte 13,14, éliminant le facteur d’exposition hétérogène de différents spécimens dans le même test. Cependant, en raison de la nature à débit lent de cette méthode, elle n’est pas couramment utilisée comme outil de surveillance de la susceptibilité aux insecticides pour les populations de moustiques. Cet article présente un protocole modifié pour l’essai biologique d’application topique qui permet des expositions à débit plus élevé tout en corrigeant la variation de la masse d’insectes, un paramètre qui est corrélé aux changements dans la sensibilité aux insecticides12. Une réduction du bruit et de la variation de masse des données de mortalité résultant d’une exposition variable aux insecticides permettrait une surveillance plus précise de la résistance technique11,15. Ces données pourraient être utilisées pour associer plus précisément la résistance phénotypique aux marqueurs génétiques, aux paramètres de condition physique et/ou à la compétence vectorielle. De plus, nous démontrons comment ce test pourrait facilement être adapté à d’autres espèces d’insectes en utilisant l’essai biologique d’application topique sur les mouches des fruits, une espèce d’insecte plus petite.
La principale limite des applications de contact résiduel susmentionnées est que l’exposition aux insecticides peut varier d’un échantillon à l’autre dans le même essai. Dans le cas des essais biologiques en bouteille du CDC et de la méthode de contact, l’exposition à l’insecticide peut varier entre les répétitions du même essai. Les insectes sont exposés à un insecticide qui est soit distribué à l’intérieur d’une bouteille en verre (essai biologique en bouteille cdc et méthode de contact), soit sur des papiers imprégnés (test en tube de l’OMS). La concentration d’insecticide sur les deux surfaces (verre et papier) est connue et prédéterminée par le dépistage de différentes espèces de génotypes connus. Cependant, la quantité disponible pour être potentiellement absorbée par l’insecte peut varier considérablement en fonction de la surface utilisée, des composants du mélange d’insecticides et de l’homogénéité avec laquelle l’insecticide est réparti sur le matériau de surface16,17. Dans le test biologique de la bouteille CDC, le revêtement insecticide à l’intérieur de la bouteille dépend des procédures utilisées par chaque laboratoire et utilisateur. Dans le test en tube de l’OMS, les papiers traités à l’insecticide sont produits de manière centralisée et donc très probablement assez homogènes dans tous les laboratoires. Cependant, dans le test en tube de l’OMS, le tube d’exposition permet aux échantillons d’atterrir et de reposer sur des mailles métalliques non exposées aux insecticides, ce qui entraîne une exposition hétérogène potentielle à l’insecticide parmi les échantillons de chaque essai. La quantité réelle d’insecticide ramassée et absorbée par les spécimens par chaque méthode doit encore être explorée plus avant18.
En outre, le test biologique en bouteille du CDC, le test en tube de l’OMS et la méthode de contact sont le plus souvent utilisés comme tests de seuil ne testant qu’une seule concentration d’insecticide prédéterminée. Cette approche permet de détecter avec précision la présence de résistance et est utile pour la surveillance de la résistance (en particulier lorsque la résistance se propage). Cependant, les tests de seuil ne peuvent pas quantifier la force de la résistance, ce qui pourrait être plus prédictif de l’efficacité des outils d’intervention. Si plusieurs concentrations d’insecticide sont utilisées avec ces méthodes, elles peuvent être utilisées comme tests d’intensité. Les tests d’intensité pour l’essai biologique en bouteille du CDC et le test en tube de l’OMS ont été introduits en testant 5x et 10x les doses discriminantes prédéterminées pour combler cette lacune dans la surveillance 6,19. Tout en offrant une plus grande capacité à différencier les populations résistantes, 3-5 doses (prédéterminées) fournissent une résolution limitée pour calculer les concentrations létales. De plus, des moustiques de différentes tailles sont utilisés dans de tels tests. Pourtant, il est important de mesurer la masse car les échantillons plus grands peuvent avoir besoin d’une dose plus élevée pour être tués, car la dose efficace par unité de masse sera beaucoup plus faible que celle d’un organisme plus petit12. Le calcul d’une dose létale relativisée en masse (quantité d’insecticide par masse d’insecte) serait une mesure plus utile que la concentration létale plus courante (p. ex., quantité d’insecticide par surface) car elle tient compte de la variation de la masse d’insectes entre les sexes, les populations et les génotypes. De telles données aideraient à combler l’écart entre la résistance génotypique et phénotypique en laboratoire et sur le terrain et pourraient également fournir un moyen facile de calculer la concentration d’application nécessaire pour traiter une population d’insectes d’une masse moyenne connue.
L’utilisation de doses létales relativisées en masse qui tuent 50% des échantillons (DL 50) intègre également plusieurs autres avantages. L’évaluation de la toxicité d’un composé spécifique en mg/kg (= ng/mg) est la norme en toxicologie humaine et vétérinaire14, et les valeurs DL50 figurent sur les fiches de données de sécurité. Les doses létales permettent également une comparaison directe de la toxicité entre différents produits chimiques pour une espèce particulière ou le même produit chimique pour différentes espèces20, ainsi qu’une évaluation de haute qualité de nouveaux insecticides et produits chimiques13. De plus, la DL50 peut fournir des rapports de résistance plus significatifs et plus précis que ceux dérivés des résultats de la mortalité par dose diagnostique, ce qui peut entraîner une surestimation du niveau de résistance présent dans une population. Par conséquent, ce test conviendrait aux programmes de surveillance de routine en fournissant une surveillance plus rigoureuse de la résistance basée sur des doses létales relativisées en masse dérivées de plus d’échantillons que celles recommandées pour d’autres essais biologiques21.
La méthode d’application topique a été utilisée dans la surveillance de la sensibilité aux insecticides pour les moustiques et les mouches comme alternative aux essais biologiques standard de sensibilité aux insecticides lorsque la résistance est déjà connue ou soupçonnée22,23, ainsi que pour la surveillance chez certains insectes nuisibles24 afin d’évaluer plus précisément les profils de résistance et la toxicité intrinsèque des insecticides21 . Dans les essais biologiques d’application topique, l’insecticide est appliqué sur chaque organisme, ce qui entraîne une variation minimale de l’exposition à l’insecticide. Cet article présente une méthode légèrement adaptée et améliorée qui permet d’appliquer l’exposition à l’insecticide sur un grand nombre d’insectes en peu de temps tout en contrôlant la massed’insectes 22. Cette méthode à débit plus élevé avec de bons niveaux de reproductibilité pourrait être un outil supplémentaire utile pour la surveillance systématique de la susceptibilité aux insecticides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente un protocole adapté pour le test d’application topique pour les moustiques et les mouches des fruits. Cette procédure pourrait être facilement adaptée pour être utilisée sur le terrain et avec d’autres organismes car elle nécessite un équipement spécialisé minimal. Vous trouverez ci-dessous les étapes critiques de ce protocole, les modifications potentielles, les conseils de dépannage, les limites de la méthode et l’importance de cette méthode.
Étapes critiques du protocole : Il y a trois étapes critiques dans le protocole qui, si elles ne sont pas effectuées correctement, peuvent avoir un impact considérable sur les résultats de l’essai biologique : la précision de la concentration d’insecticide, l’élimination des échantillons et l’évaluation de la mortalité.
Précision de la concentration d’insecticide:
Il est extrêmement important d’avoir des solutions insecticides précises pour obtenir des courbes dose-réponse reproductibles et des résultats significatifs. L’approche volumétrique de la préparation d’une solution insecticide est plus courante dans la littérature pour le bioessaisen bouteille 7 du CDC et les applications topiques 13,14,43. Cependant, l’approche gravimétrique décrite ici est intrinsèquement plus précise en raison de la prise en compte de la température par l’inclusion de la densité (spécifique à la température), ce qui conduit à une préparation de formulation plus précise.
Spécimen knockdown:
L’abattage des échantillons est un élément essentiel de cette méthode et permet l’administration précise de l’insecticide et les mesures de poids. Cependant, l’élimination des organismes comporte inévitablement un risque de stress physique et de dommages, comme démontré précédemment30. Par conséquent, soyez prudent et attentif lorsque vous renversez les spécimens pour vous assurer i) que chaque spécimen est renversé pour une durée similaire, ii) que la longueur de l’abattage est réduite au minimum et iii) que la méthode d’abattage est maintenue cohérente dans tous les spécimens. De plus, il est conseillé de tester la méthode knockdown séparément, avant l’application d’insecticide, pour s’assurer que la méthode est efficace et n’induit pas de mortalité de contrôle supérieure à 10%. Le test initial peut prendre plus de temps pour un utilisateur inexpérimenté, ce qui entraîne des temps de knockdown plus longs. Par conséquent, soyez prudent lors de l’interprétation des résultats des premiers essais.
Évaluation de la mortalité :
L’évaluation de la mortalité peut être difficile, surtout lorsque l’insecticide ne tue pas complètement, mais ne fait que renverser ou mutiler le moustique ou la mouche. Par conséquent, il est important de connaître l’impact de l’insecticide sur l’organisme cible et d’avoir une définition claire des organismes « morts » (ou renversés) avant de commencer. De plus, il est recommandé que la même personne évalue la mortalité entre les doses et les répétitions afin de réduire la variation.
Modifications du protocole : Plusieurs modifications décrites ci-dessous peuvent être appliquées à ce protocole pour améliorer sa polyvalence et son accessibilité.
Adaptation du test aux insectes de plus ou moins grande taille :
Lors de l’utilisation d’échantillons plus petits ou plus grands, il est conseillé d’appliquer un volume d’insecticide plus ou moins important, respectivement. À titre d’exemple, nous avons adapté le protocole anti-moustiques aux mouches des fruits en réduisant la dose de 0,5 μL à une dose de 0,2 μL. Assurez-vous que la bonne taille de seringue est choisie pour le volume de dose choisi.
Adaptation du test aux insectes des champs :
Lors de l’utilisation d’insectes de terrain, il peut y avoir plus de variation dans la taille des insectes. Par conséquent, il serait recommandé de peser les insectes en petits groupes (p. ex., par tasse) plutôt qu’en grand groupe (p. ex., tous les insectes utilisés pour une expérience). Cela peut aider à saisir la variation potentielle de la susceptibilité aux insecticides associée aux différences de masse des insectes des champs.
Modifications de l’équipement :
Tente de manipulation d’insectes: Le dosage de l’échantillon peut être effectué sous une tente de manipulation d’insectes qui est simplement construite avec un tuyau en PVC et une moustiquaire. Cela peut être une solution de rechange à une pièce fermée (p. ex., insecticide) et aider à éliminer la contamination insecticide potentielle dans les zones où l’élevage d’insectes pourrait avoir lieu. Cette tente de manipulation d’insectes est facile à construire et peu coûteuse (~ 70 $). Alternativement, une cage de manipulation d’insectes pourrait être achetée (~ 425 $).
Table de refroidissement : Des sacs de glace ou des plateaux de glace peuvent être utilisés pour abattre l’échantillon et/ou garder l’échantillon renversé.
Incubateur: Les incubateurs sont recommandés pour élever l’échantillon et le conserver pendant 24 heures après le traitement insecticide. Si un incubateur n’est pas disponible, il peut être construit. L’équipement nécessaire à la construction de l’incubateur comprend un conteneur isotherme, un humidificateur, des câbles chauffants, un régulateur d’humidité et de température et une lumière, ce qui devrait représenter un coût total d’environ 170 $, suivant et développant les méthodesprécédentes 44.
Gobelets de maintien : Bien que des gobelets en plastique soient utilisés pour trier et retenir l’échantillon traité, des gobelets en papier doublés de cire ou des contenants en verre seraient des solutions de rechange appropriées.
Modification de l’organisme et du stade de vie :
Cette méthode est très adaptable pour une utilisation avec d’autres vecteurs, insectes et / ou arthropodes tels que les moustiques Culex quinquefasciatus 32, les mouches domestiques32 et les cafards45, ainsi que les stades de vie non adultes, tels que les larves de moustiques46.
Modification de l’emplacement de l’application topique :
Cette méthode décrit l’application de l’insecticide sur le thorax ventral et la région de l’abdomen pour les moustiques (et le dos pour les mouches des fruits). Cependant, d’autres emplacements d’application peuvent être utilisés tant que le site d’exposition est cohérent. La cohérence est importante car la sensibilité à l’insecticide peut varier en fonction de l’emplacement d’application32.
Conseils de dépannage : Cette méthode comporte plusieurs étapes qui sont initialement difficiles. Vous trouverez ci-dessous quelques-uns des problèmes les plus courants que l’on pourrait rencontrer.
Solutions insecticides qui fuient/s’évaporent :
Les insecticides sont généralement dissous dans l’acétone, un composé hautement volatil. Cela signifie que l’acétone s’évapore rapidement à température ambiante, augmentant les concentrations d’insecticide au fil du temps. Si les solutions insecticides semblent fuir ou s’évaporer, refaire les solutions, s’assurer que le couvercle du tube est bien verrouillé et vérifier que les protocoles d’entreposage sont correctement respectés (p. ex., un parafilm est utilisé et les tubes sont entreposés à la verticale). Si une fuite persiste, essayez de remplir les tubes avec un volume plus faible pour laisser plus de place au changement de volume que l’acétone éprouve à différentes températures. De plus, si vous utilisez de l’acétone comme solvant, assurez-vous que les tubes sont conçus pour le stockage de l’acétone (p. ex., plastiques FEP, TFE et PFA). Si vous utilisez des insecticides hydrophobes, conservez les solutions dans des flacons en verre (car les insecticides hydrophobes adhèrent moins au verre que le plastique). Il est également recommandé de marquer le ménisque de la solution avant le stockage pour surveiller l’évaporation.
Poids dérivant sur microbalance lors de la pesée des organismes:
Si la lecture du poids sur la balance dérive (montant ou descendant lentement), cela pourrait être dû à la statique. La dérive se produit le plus souvent lors de la pesée d’organismes dans des articles en plastique, car le plastique peut facilement contenir une charge statique. Pour éviter cela, un papier de pesage peut être placé sous le récipient en plastique à peser, ou un récipient non plastique tel que du verre peut être utilisé.
Résultats anormaux de mortalité :
Il existe de nombreuses façons dont les résultats de mortalité peuvent sembler anormaux, comme l’observation d’une mortalité élevée chez les témoins ou d’une mortalité élevée / faible pour toutes les doses d’insecticide. Passez en revue les cas suivants pour résoudre chaque scénario.
Mortalité contrôlée élevée
S’il y a une mortalité élevée dans le groupe témoin (10 % ou plus), évaluez la méthode de renversement et la durée pendant laquelle les échantillons sont renversés. Si possible, raccourcissez la durée pendant laquelle les spécimens sont renversés. D’autres facteurs potentiels à prendre en compte pour une mortalité élevée chez les témoins comprennent i) la vérification si les paramètres de l’incubateur sont corrects – des températures anormales et / ou de l’humidité pourraient entraîner une mortalité accrue. La température et l’humidité doivent être vérifiées à l’aide d’un enregistreur de données indépendant. ii) Évaluation de la manipulation des insectes. Manipuler les insectes trop ou trop grossièrement pourrait entraîner une mortalité élevée. iii) Vérifier s’il n’y a pas de contamination insecticide dans l’acétone à 100 % utilisée pour traiter le groupe témoin ou sur l’instrumentation. Remplacez l’acétone et nettoyez tous les instruments avec de l’acétone ou de l’éthanol. Évitez la contamination en remplaçant fréquemment les gants, en empêchant les déversements et en nettoyant les instruments. Notez que dans le dossier supplémentaire 3, un maximum de deux moustiques sont morts dans les tasses témoins (acétone seulement). Ce niveau de mortalité n’est pas considéré comme élevé (il est inférieur à 10%), et par conséquent, il n’y avait pas lieu de s’inquiéter.
Mortalité élevée dans tous les groupes exposés (mais pas dans les groupes témoins)
Utilisez des concentrations d’insecticide plus faibles ou des volumes de dose plus faibles pour les tests. Les doses utilisées peuvent être supérieures à la dose minimale qui n’induira pas de mortalité. Utilisez plusieurs dilutions 10 fois pour identifier la plage de doses correcte et exclure la contamination. Pour éviter la contamination, commencez à doser avec la concentration la plus faible et travaillez vers la concentration la plus élevée. De plus, assurez-vous que tout l’équipement utilisé est régulièrement nettoyé avec de l’acétone et / ou de l’éthanol, que les doses appliquées à l’échantillon sont très faibles et que même la moindre contamination croisée pourrait avoir un impact sur les résultats.
Faible mortalité dans tous les groupes exposés
Utilisez des concentrations d’insecticide plus élevées. Les doses utilisées peuvent toutes être trop faibles pour causer la mortalité dans la population. Pour identifier la plage de doses correcte, exposez les échantillons à plusieurs doses plus concentrées de 10 fois. S’assurer que les solutions insecticides n’ont pas expiré ou dégradé (potentiellement en raison d’une température élevée ou d’une exposition à la lumière). Si les solutions ont expiré ou sont soupçonnées de s’être dégradées, refaites les solutions et assurez-vous que les conditions de stockage appropriées sont respectées.
Mortalité incohérente entre les répétitions/jours
Le moment de la journée où les insectes sont exposés à l’insecticide pourrait affecter le niveau de résistance exprimé, en particulier pour la résistance métabolique34. Répétez ce protocole pendant la même période de temps chaque jour pour éviter que l’heure de la journée ne soit une variable potentielle contribuant aux changements dans la mortalité. D’autres facteurs potentiels contribuant à une mortalité incohérente entre les répétitions comprennent i) les spécimens élevés différemment entre les expériences. S’assurer que tous les spécimens sont de la même tranche d’âge, élevés à la même température et aux mêmes densités et disponibilités alimentaires. ii) les concentrations d’insecticides se dégradent avec le temps ou deviennent plus concentrées en raison de l’évaporation de l’acétone. Refaites les solutions et assurez-vous de bonnes conditions de stockage. iii) Score de mortalité incohérent. Assurez-vous que la même personne enregistre la mortalité ou élaborez un protocole clair à utiliser de manière cohérente dans l’ensemble de l’équipe. Utilisez la notation à l’aveugle pour réduire le biais dans la notation de la mortalité.
Insectes collant à la surface du plateau de tri:
L’acétone réagit aux plastiques utilisés dans ce protocole, tels que les boîtes de Pétri. L’échantillon adhérera probablement à la surface s’il utilise de l’acétone sur des boîtes de Pétri ou des surfaces en plastique similaires. Cette adhérence peut être évitée en tapissant le bac de tri avec du papier de pesage ou en utilisant un bac de tri non plastique. De plus, la condensation à la surface du plastique dans le plateau de tri ou les gobelets de retenue peut entraîner l’adhérence des insectes à la condensation, ou l’échantillon peut être trop froid et potentiellement geler à la surface. Ajustez la méthode d’élimination pour réduire la condensation tout en évitant que les échantillons ne deviennent trop froids ou gelés (p. ex., placez le papier de pesée entre les échantillons et le bac de tri en plastique).
Erreurs d’analyse R :
Une fois les données sur la mortalité recueillies, diverses complications peuvent survenir au cours de l’analyse. La raison la plus courante pour laquelle un code R ne peut pas effectuer les actions du fichier de données est que le format de données ne correspond pas au code (par exemple, les en-têtes de colonne et/ou les cellules vides). Si des complications plus graves surviennent, reportez-vous aux pages d’aide R intégrées à Rstudio35.
Limites de la méthode d’application topique décrite ci-dessus:
L’absorption d’insecticide par voie d’application topique n’imite pas l’exposition naturelle:
L’application topique sur le corps primaire n’est pas le moyen naturel d’absorption de l’insecticide. Sur le terrain, les insectes absorbent principalement les insecticides par leurs pattes pendant la durée de leur contact avec la surface traitée à l’insecticide ou sur leurs ailes par de petites particules d’aérosol 47,48, plutôt qu’une exposition rapide sur la surface ventrale. Cependant, l’application directe d’une dose connue d’insecticide établira avec précision une réponse phénotypique aux insecticides, nécessaire pour des études génétiques et évolutives ou des comparaisons de la susceptibilité aux insecticides dans l’espace ou le temps. Par conséquent, cette approche est bénéfique pour tester la résistance technique mais ne mesurera pas directement la résistance pratique (l’efficacité de l’outil d’intervention réel dans un contexte de terrain15). Cependant, il est important de noter que les méthodes standard actuelles (par exemple, les tests en tube de l’OMS et les essais biologiques sur les bouteilles du CDC) ne peuvent pas non plus capturer ou imiter l’exposition aux aérosols (c’est-à-dire par buée) aux insecticides sur le terrain.
Les essais d’application topique ne peuvent évaluer que les insecticides d’absorption de contact:
Cette méthode est destinée aux insecticides qui agissent par contact et absorption de l’insecticide et non pour une utilisation avec des insecticides oraux, tels que l’acide borique couramment utilisé dans les appâts à sucre toxique attrayants49.
Signification de la méthode:
La méthode d’application topique élargit les normes bien établies pour les essais biologiques d’insecticides en calculant la dose létale (et non la concentration) et en mesurant la résistance technique (non pratique)15. Vous trouverez ci-dessous les avantages et les inconvénients de cette méthode par rapport aux tests de sensibilité aux insecticides existants.
Calcul de la dose létale :
Cette méthode détermine la dose létale de l’insecticide, plutôt que la concentration létale que les essais biologiques du CDC et de l’OMS utilisent pour établir la dose discriminante11. La dose létale est plus significative parce qu’il s’agit d’une quantité quantifiée d’insecticide connue pour provoquer la mortalité. En revanche, la concentration létale ne tient pas compte de la quantité d’insecticide que l’organisme acquiert réellement. Lors de l’utilisation du calcul de la dose létale, les différences entre les profils de susceptibilité dépendant du sexe ou de la taille peuvent être observées et quantifiées avec plus de précision, ce qui rend cette mesure encore plus polyvalente.
Résistance technique :
Cette méthode évalue la résistance technique, qui est la résistance mesurée dans des environnements normalisés et contrôlés. De telles mesures conviennent à la surveillance de la propagation de la résistance aux insecticides et à l’établissement d’un lien entre la résistance phénotypique et les marqueurs potentiels15. En raison de la diminution de la variation de la mortalité résultant de l’essai biologique d’application topique, il permet une meilleure identification de nouveaux marqueurs de résistance. Cependant, en raison de l’exposition non naturelle des insecticides au moustique, ce test ne convient pas à l’estimation de l’efficacité d’une intervention spécifique dans une population spécifique. D’autres essais sont nécessaires pour mesurer cette résistance pratique15.
Adaptabilité de l’échantillon :
Cette méthode peut être pratiquée sur d’autres arthropodes importants tels que les ravageurs des cultures (p. ex., le doryphore de la pomme de terre), les parasites domestiques (p. ex., les cafards et les punaises de lit) ou les pollinisateurs (p. ex., les abeilles) avec de simples changements à l’approche de démolition et/ou à la dose, au volume et/ou à la concentration d’insecticide (comme décrit ci-dessus). La facilité d’adaptabilité peut aider à analogiser la recherche sur la résistance aux insecticides dans différents domaines de recherche. L’utilisation d’une valeur LD50 au lieu d’une concentration létale qui tue 50% des spécimens (CL50) permet une comparaison précise entre les espèces.
Coût:
À l’instar des essais biologiques en bouteille du CDC et des tests en tube de l’OMS, les coûts d’exécution du test d’application topique sont minimes (voir le tableau des matériaux). Les pièces d’équipement essentielles sont la seringue (environ 70 $) et le distributeur (environ 100 $), qui sont réutilisables dans tous les essais.
Nombre de spécimens nécessaires :
Un minimum de 20 à 25 échantillons doit être utilisé par tasse d’essai d’application topique. Il est recommandé d’analyser au moins cinq concentrations d’insecticide par expérience, avec un minimum de trois répétitions recommandées pour la procédure. Dans l’ensemble, cela donne un minimum de 300 à 375 échantillons nécessaires pour un test complet, comparable au nombre d’échantillons nécessaires pour effectuer des tests d’intensité de résistance à l’aide de tests en tube de l’OMS ou de tests biologiques en bouteille du CDC. Cependant, si la variabilité réduite est obtenue avec le bioessais d’application topique, le même nombre d’échantillons peut conduire à plus de puissance statistique pour comparer les données de susceptibilité à travers l’espace ou le temps.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par un prix CAREER de la National Science Foundation à SH sous le numéro de bourse 2047572. Nous remercions Damien Rivera pour son aide dans l’élevage de mouches des fruits et la préparation pour le test d’application topique, le Dr Ganetzky de l’Université du Wisconsin-Madison pour avoir partagé sa souche de mouche des fruits Canton-S, les Centers for Disease Control and Prevention pour le partage de la souche Rockefeller et le Centre d’entomologie médicale agricole et vétérinaire du Département de l’agriculture des États-Unis pour avoir partagé la souche d’isoligne IICC. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , (2020).
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