Fare Dokularında Kararlı Mikrotübülleri, Labil Mikrotübülleri ve Serbest Tübülleri Ayırmak için Kantitatif Mikrotübül Fraksiyonlama Tekniği

Mikrotübüller (MT’ler), α/β-tübülin heterodimer alt birimlerinden oluşan protofilamentlerden oluşan uzun tübüler yapılardır. Hücre bölünmesi, hareketlilik, şekil bakımı ve hücre içi taşıma gibi çeşitli hücresel süreçlerde önemli roller oynarlar ve bu da onları ökaryotik hücre iskeletinin ayrılmaz bileşenleri haline getirir¹. α-tubulin alt biriminin açığa çıktığı MT’lerin eksi ucu nispeten kararlıyken, β-tübülin alt biriminin açığa çıktığı artı uç, dinamik depolimerizasyon ve polimerizasyona^{uğrar 2}. Dinamik kararsızlık olarak adlandırılan artı uçta bu sürekli tübülin dimer ilavesi ve ayrışma döngüsü, tekrarlayan bir kurtarma ve felaket süreciyle sonuçlanır³. MT’ler, kararlı ve kararsız alanlar dahil olmak üzere dinamik istikrarsızlıkta lokalize varyasyonlara sahip odak alanları sergiler⁴.

MT’lerin dinamik kararsızlığının hassas kontrolü, özellikle karmaşık morfolojilerle karakterize edilen nöronlarda, çok sayıda hücresel fonksiyon için çok önemlidir. MT’lerin uyarlanabilirliği ve dayanıklılığı, sinir hücrelerinin gelişiminde ve düzgün çalışmasında hayati bir rol oynar ^5,6,7. MT’lerin dinamik kararsızlığının, asetilasyon, fosforilasyon, palmitoilasyon, detirozinasyon, delta 2, poliglutamin oksidasyonu ve poliglisilasyon gibi tübülinin çeşitli translasyon sonrası modifikasyonları (PTM’ler) ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Ek olarak, mikrotübül ile ilişkili proteinlerin (MAP’ler) bağlanması, düzenleyici bir mekanizma olarak hizmet eder⁸. Asetilasyon hariç PTM’ler, ağırlıklı olarak MT’lerin dış yüzeyinde yer alan tübülin karboksi-terminal bölgesinde meydana gelir. Bu modifikasyonlar, MT’ler üzerinde çeşitli yüzey koşulları yaratarak MAP’lerle etkileşimlerini etkiler ve nihayetinde MT kararlılığını yönetir⁹. α-tübülin içinde bir karboksi-terminal tirozin kalıntısının varlığı, hızlı bir şekilde serbest tübülin havuzu ile değiştirilen dinamik MT’lerin göstergesidir. Tersine, karboksi terminalinin detirozinasyonu ve Lys40’ın asetilasyonu, azaltılmış dinamik kararsızlığa sahip kararlı MT’leri ifade eder ^9,10.

Tübülin PTM’leri,^MT’lerin 5,7,11,12,13,14,15’in dinamiklerini ve kararlılığını değerlendirmek için deneylerde yaygın olarak kullanılmıştır. Örneğin, hücre kültürü çalışmalarında, tübülinler iki havuza ayrılabilir: serbest tübülin havuzu ve MT havuzu. Bu, kalan MT’leri ^{15,16,17,18,19} sabitlemeden önce hücre geçirgenliği yoluyla serbest tübülin salınarak elde edilir. Biyokimyasal yöntemler, MT’leri felaketten koruyan, MT’lerin ve serbest tübülinin santrifüjleme yoluyla ayrılmasını sağlayan kimyasal MT stabilizatörlerinin kullanımını içerir^20,21,22. Bununla birlikte, bu prosedürler stabil ve daha az stabil (kararsız) MT’ler arasında ayrım yapmaz, bu nedenle beyin gibi dokularda MT’leri veya çözünür tübülini ölçmeyi imkansız hale getirir. Sonuç olarak, fizyolojik ve patolojik koşullar altında organizmalarda MT stabilitesini değerlendirmenin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu deneysel sınırlamayı ele almak için, fare dokusunda MT’leri ve serbest tübülini hassas bir şekilde ayırmak için yeni bir teknik geliştirdik²³.

Bu benzersiz MT fraksiyonlama yöntemi, dokularda tübülin durumunu koruyan koşullar altında doku homojenizasyonunu ve kararlı MT’leri, kararsız MT’leri ve serbest tübülini ayırmak için iki aşamalı santrifüjlemeyi içerir. Bu basit prosedür, canlı organizmalarda MT’ler ve MAP’ler üzerine temel araştırmalar, MT stabilitesi ile ilişkili sağlık ve hastalıkların fizyolojik ve patolojik analizleri ve MT’leri hedef alan ilaçlar ve diğer terapötiklerin geliştirilmesi dahil olmak üzere geniş çalışmalara uygulanabilir.