Tecnica di frazionamento quantitativo dei microtubuli per separare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti di topo

I microtubuli (MT) sono strutture tubolari allungate costituite da protofilamenti costituiti da subunità eterodimeriche di α/β-tubulina. Svolgono ruoli essenziali in vari processi cellulari come la divisione cellulare, la motilità, il mantenimento della forma e il trasporto intracellulare, rendendoli componenti integrali del citoscheletro eucariotico¹. L’estremità negativa delle MT, in cui è esposta la subunità α-tubulina, è relativamente stabile, mentre l’estremità negativa, in cui è esposta la subunità β-tubulina, subisce depolimerizzazione dinamica e polimerizzazione². Questo ciclo continuo di aggiunta e dissociazione del dimero di tubulina all’estremità positiva, indicato come instabilità dinamica, si traduce in un processo ripetitivo di salvataggio e catastrofe³. Le MT presentano domini focali con variazioni localizzate nell’instabilità dinamica, inclusi domini stabili e labili⁴.

Il controllo preciso dell’instabilità dinamica delle MT è fondamentale per numerose funzioni cellulari, in particolare nei neuroni caratterizzati da morfologie complesse. L’adattabilità e la durata delle MT svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nel corretto funzionamento delle cellule nervose ^5,6,7. È stato riscontrato che l’instabilità dinamica delle MT è associata a varie modificazioni post-traduzionali (PTM) della tubulina, come l’acetilazione, la fosforilazione, la palmitoilazione, la detirosinazione, il delta 2, l’ossidazione della poliglutammina e la poliglicilazione. Inoltre, il legame delle proteine associate ai microtubuli (MAP) funge da meccanismo di regolazione⁸. I PTM, esclusa l’acetilazione, si trovano prevalentemente nella regione carbossi-terminale della tubulina situata sulla superficie esterna delle MT. Queste modificazioni creano diverse condizioni superficiali sulle MT, influenzando la loro interazione con le MAP e, in ultima analisi, governando la stabilità della MT⁹. La presenza di un residuo di tirosina carbossi-terminale nella α-tubulina è indicativa di MT dinamiche, che vengono rapidamente sostituite dal pool di tubulina libera. Al contrario, la detirosinazione dell’estremità carbossilica e l’acetilazione di Lys40 indicano MT stabili con ridotta instabilità dinamica ^9,10.

I PTM della tubulina sono stati ampiamente impiegati in esperimenti per valutare la dinamica e la stabilità delle MT 5,7,11,12,13,14,15. Ad esempio, negli studi sulle colture cellulari, le tubuline possono essere segregate in due pool: il pool di tubulina libera e il pool MT. Ciò si ottiene liberando la tubulina libera attraverso la permeabilizzazione cellulare prima di fissare le MT rimanenti 15,16,17,18,19. I metodi biochimici prevedono l’uso di stabilizzatori chimici MT che salvaguardano le MT dalla catastrofe, consentendo la separazione delle MT e della tubulina libera attraverso la centrifugazione^20,21,22. Tuttavia, queste procedure non distinguono tra MT stabili e meno stabili (labili), rendendo così impossibile quantificare le MT o la tubulina solubile in tessuti come il cervello. Di conseguenza, la valutazione della stabilità della MT negli organismi in condizioni fisiologiche e patologiche si è rivelata impegnativa. Per affrontare questa limitazione sperimentale, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per separare con precisione le MT e la tubulina libera nel tessuto di topo²³.

Questo metodo unico di frazionamento MT prevede l’omogeneizzazione dei tessuti in condizioni che mantengono lo stato di tubulina nei tessuti e la centrifugazione in due fasi per separare le MT stabili, le MT labili e la tubulina libera. Questa semplice procedura può essere applicata a studi ampi, tra cui la ricerca di base su MT e MAP negli organismi viventi, analisi fisiologiche e patologiche della salute e delle malattie associate alla stabilità della MT e lo sviluppo di farmaci e altre terapie mirate alle MT.