تقنية تجزئة الأنابيب الدقيقة الكمية لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة والأنابيب الدقيقة المرنة والتوبولين الحر في أنسجة الفئران
Summary
تلعب الأنابيب الدقيقة ، وهي بوليمرات توبولين ، دورا مهما كمكون للهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة ومعروفة بعدم استقرارها الديناميكي. طورت هذه الدراسة طريقة لتجزئة الأنابيب الدقيقة لفصلها إلى أنابيب دقيقة مستقرة ، وأنابيب دقيقة قابلة للتعديل ، وتوبولين حر لتقييم استقرار الأنابيب الدقيقة في أنسجة الفئران المختلفة.
Abstract
الأنابيب الدقيقة ، المكونة من دايمرات α / β-توبولين ، هي عنصر حاسم في الهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة. تظهر هذه البوليمرات الشبيهة بالأنبوب عدم استقرار ديناميكي حيث تخضع الوحدات الفرعية غير المتجانسة للتوبولين للبلمرة المتكررة وإزالة البلمرة. يعد التحكم الدقيق في استقرار وديناميكيات الأنابيب الدقيقة ، والذي يتحقق من خلال تعديلات توبولين بعد الترجمة والبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة ، أمرا ضروريا لمختلف الوظائف الخلوية. الاختلالات في الأنابيب الدقيقة متورطة بقوة في التسبب في المرض ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية. تركز الأبحاث الجارية على العوامل العلاجية التي تستهدف الأنابيب الدقيقة التي تعدل الاستقرار ، مما يوفر خيارات علاجية محتملة لهذه الأمراض والسرطانات. وبالتالي ، فإن فهم الحالة الديناميكية للأنابيب الدقيقة أمر بالغ الأهمية لتقييم تطور المرض والآثار العلاجية.
تقليديا ، تم تقييم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في المختبر أو في الخلايا المستزرعة من خلال التجزئة الخشنة أو المقايسة المناعية ، باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف تعديلات ما بعد الترجمة من توبولين. ومع ذلك ، فإن التحليل الدقيق لحالة التوبولين في الأنسجة باستخدام مثل هذه الإجراءات يشكل تحديات. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة تجزئة الأنابيب الدقيقة البسيطة والمبتكرة لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة ، والأنابيب الدقيقة المرنة ، والتوبولين الحر في أنسجة الفئران.
تضمن الإجراء تجانس أنسجة الفئران المشرحة في مخزن مؤقت لتثبيت الأنابيب الدقيقة بنسبة حجم 19: 1. ثم تم تجزئة التجانسات من خلال عملية طرد مركزي فائقة من خطوتين بعد الطرد المركزي البطيء الأولي (2400 × جم) لإزالة الحطام. أدت خطوة الطرد المركزي الفائق الأولى (100000 × جم) إلى ترسب الأنابيب الدقيقة المستقرة ، بينما تعرض العنصر الطافي الناتج لخطوة الطرد المركزي الفائقة الثانية (500000 × جم) لتجزئة الأنابيب الدقيقة القابلة للذوبان وثنائيات التوبولين القابلة للذوبان. حددت هذه الطريقة نسب التوبولين التي تشكل أنابيب دقيقة مستقرة أو قابلة للذوبان في دماغ الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت اختلافات الأنسجة المتميزة في استقرار الأنابيب الدقيقة التي ترتبط بالقدرة التكاثرية للخلايا المكونة. تسلط هذه النتائج الضوء على الإمكانات الكبيرة لهذه الطريقة الجديدة لتحليل استقرار الأنابيب الدقيقة في الظروف الفسيولوجية والمرضية.
Introduction
الأنابيب الدقيقة (MTs) هي هياكل أنبوبية ممدودة تتكون من خيوط أولية تتكون من وحدات فرعية غير متجانسة α / β-توبولين. تلعب أدوارا أساسية في العمليات الخلوية المختلفة مثل انقسام الخلايا والحركة والحفاظ على الشكل والنقل داخل الخلايا ، مما يجعلها مكونات متكاملة للهيكل الخلوي حقيقي النواة1. الطرف السالب من MTs ، حيث تتعرض الوحدة الفرعية α-tubulin ، مستقر نسبيا ، في حين أن الطرف الزائد ، حيث تتعرض الوحدة الفرعية β-tubulin ، يخضع لإزالة البلمرة الديناميكيةوالبلمرة 2. هذه الدورة المستمرة من إضافة توبولين ديمر وتفككه في الطرف الزائد ، يشار إليها باسم عدم الاستقرار الديناميكي ، تؤدي إلى عملية متكررة للإنقاذ والكارثة3. تعرض MTs مجالات محورية مع اختلافات محلية في عدم الاستقرار الديناميكي ، بما في ذلك المجالات المستقرة والمرنة4.
يعد التحكم الدقيق في عدم الاستقرار الديناميكي ل MTs أمرا بالغ الأهمية للعديد من الوظائف الخلوية ، لا سيما في الخلايا العصبية التي تتميز بأشكال معقدة. تلعب القدرة على التكيف والمتانة في MTs دورا حيويا في تطوير الخلايا العصبية5،6،7 وحسن سيرها. تم العثور على عدم الاستقرار الديناميكي ل MTs مرتبطا بالعديد من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) للتوبولين ، مثل الأستلة ، والفسفرة ، وبالميتويل ، وإزالة التيروزين ، ودلتا 2 ، وأكسدة البولي جلوتامين ، و polyglycylation. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل ارتباط البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) كآلية تنظيمية8. تحدث PTMs ، باستثناء الأستيل ، في الغالب في منطقة كربوكسي توبولين الطرفية الواقعة على السطح الخارجي ل MTs. تخلق هذه التعديلات ظروفا سطحية متنوعة على MTs ، مما يؤثر على تفاعلها مع MAPs ويحكم في النهاية استقرار MT9. يدل وجود بقايا التيروزين الكربوكسي الطرفي في α-tubulin على MTs الديناميكي ، والذي يتم استبداله بسرعة بتجمع توبولين مجاني. على العكس من ذلك ، فإن إزالة التيروزين من نهاية الكربوكسي وأستلة Lys40 تدل على MTs مستقرة مع انخفاض عدم الاستقرار الديناميكي 9,10.
تم استخدام PTMs من توبولين على نطاق واسع في التجارب لتقييم ديناميكيات واستقرار MTs5،7،11،12،13،14،15. على سبيل المثال ، في دراسات زراعة الخلايا ، يمكن فصل الأنابيب إلى مجموعتين: تجمع توبولين مجاني وتجمع MT. يتم تحقيق ذلك عن طريق إطلاق توبولين مجاني من خلال نفاذية الخلية قبل تثبيت MTsالمتبقية 15،16،17،18،19. تتضمن الطرق البيوكيميائية استخدام مثبتات MT الكيميائية التي تحمي MTs من الكارثة ، مما يتيح فصل MTs والتوبولين الحر من خلال الطرد المركزي20،21،22. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات لا تفرق بين MTs المستقرة والأقل استقرارا (المتقلبة) ، مما يجعل من المستحيل تحديد MTs أو التوبولين القابل للذوبان في أنسجة مثل الدماغ. وبالتالي ، فقد ثبت أن تقييم استقرار MT في الكائنات الحية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية يمثل تحديا. لمعالجة هذا القيد التجريبي ، قمنا بتطوير تقنية جديدة لفصل MTs والتوبولين الحر بدقة في أنسجة الفئران23.
تتضمن طريقة تجزئة MT الفريدة هذه تجانس الأنسجة في ظل ظروف تحافظ على حالة التوبولين في الأنسجة والطرد المركزي من خطوتين لفصل MTs المستقر و MTs المرن والتوبولين الحر. يمكن تطبيق هذا الإجراء البسيط على دراسات واسعة ، بما في ذلك البحوث الأساسية على MTs و MAPs في الكائنات الحية ، والتحليلات الفسيولوجية والمرضية للصحة والأمراض المرتبطة باستقرار MT ، وتطوير الأدوية والعلاجات الأخرى التي تستهدف MTs.
Protocol
Representative Results
Discussion
المهمة الأكثر أهمية عند التحقيق في حالة توبولين في الأنسجة من الكائنات الحية هي منع بلمرة MT العرضية أو إزالة البلمرة أثناء التحضير. يتأثر استقرار MTs في العينات بعوامل مثل تركيز Taxol في MSB ، ونسبة كمية الأنسجة إلى المخزن المؤقت ، ودرجة الحرارة أثناء العملية من إزالة الأنسجة إلى التجانس والطر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JST لإنشاء زمالات جامعية نحو إنشاء ابتكار تكنولوجيا العلوم (A.HT. JPMJFS2145) ، JST SPRING (A.HT. ؛ JPMJSP2129) ، منحة مساعدة لزملاء JSPS (A.HT ؛ 23KJ2078) ، منحة مساعدة للبحث العلمي (B) JSPS KAKENHI (22H02946 ل TM) ، منحة مساعدة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة بعنوان “شيخوخة بروتين الدماغ والتحكم في الخرف” من MEXT (TM ؛ 26117004) ، وزمالة Uehara Research من مؤسسة Uehara Memorial Foundation (TM ؛ 202020027). يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Materials
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| AKTA prime plus | Cytiva | ||
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
- Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
- Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
- Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
- Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
- Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).
- Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
- Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
- Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
- Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
- Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
- Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
- Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
- Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
- Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
- Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
- Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
- Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
- Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
- Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
- Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer’s presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
- Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
- Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer’s disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
- Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer’s disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
- Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
- Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).
