Kwantitatieve fractioneringstechniek voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden

Microtubuli (MT’s) zijn langwerpige buisvormige structuren die bestaan uit protofilamenten die bestaan uit α/β-tubuline heterodimeersubeenheden. Ze spelen een essentiële rol in verschillende cellulaire processen, zoals celdeling, beweeglijkheid, vormbehoud en intracellulair transport, waardoor ze integrale componenten zijn van het eukaryote cytoskelet¹. Het min-uiteinde van MT’s, waar de α-tubuline-subeenheid wordt blootgesteld, is relatief stabiel, terwijl het plus-uiteinde, waar de β-tubuline-subeenheid wordt blootgesteld, dynamische depolymerisatie en polymerisatie ondergaat². Deze continue cyclus van tubulinedimeeradditie en dissociatie aan het plus-uiteinde, aangeduid als dynamische instabiliteit, resulteert in een repetitief proces van redding en catastrofe³. MT’s vertonen focale domeinen met gelokaliseerde variaties in dynamische instabiliteit, waaronder stabiele en labiele domeinen⁴.

Nauwkeurige controle van de dynamische instabiliteit van MT’s is cruciaal voor tal van cellulaire functies, met name in neuronen die worden gekenmerkt door ingewikkelde morfologieën. Het aanpassingsvermogen en de duurzaamheid van MT’s spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling en het goed functioneren van zenuwcellen ^5,6,7. De dynamische instabiliteit van MT’s blijkt geassocieerd te zijn met verschillende posttranslationele modificaties (PTM’s) van tubuline, zoals acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinatie, delta 2, polyglutamine-oxidatie en polyglycylering. Bovendien dient de binding van microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAP’s) als een regulerend mechanisme⁸. PTM’s, met uitzondering van acetylering, komen voornamelijk voor in het tubuline-carboxy-terminale gebied dat zich aan de buitenkant van MT’s bevindt. Deze modificaties creëren verschillende oppervlaktecondities op MT’s, beïnvloeden hun interactie met MAP’s en bepalen uiteindelijk de stabiliteit van MT’s⁹. De aanwezigheid van een carboxy-terminaal tyrosineresidu in α-tubuline is een indicatie van dynamische MT’s, die snel worden vervangen door de vrije tubulinepool. Omgekeerd duiden detyrosinatie van het carboxy-eindpunt en acetylering van Lys40 op stabiele MT’s met verminderde dynamische instabiliteit ^9,10.

De PTM’s van tubuline zijn uitgebreid gebruikt in experimenten om de dynamiek en stabiliteit van MT’s 5,7,11,12,13,14,15 te beoordelen. In celkweekstudies kunnen tubulines bijvoorbeeld worden gescheiden in twee pools: de vrije tubulinepool en de MT-pool. Dit wordt bereikt door vrije tubuline vrij te geven door celpermeabilisatie voordat de resterende MT’s 15,16,17,18,19 worden gefixeerd. Biochemische methoden omvatten het gebruik van chemische MT-stabilisatoren die MT’s beschermen tegen catastrofe, waardoor de scheiding van MT’s en vrije tubuline mogelijk wordt door middel van centrifugatie^20,21,22. Deze procedures maken echter geen onderscheid tussen stabiele en minder stabiele (labiele) MT’s, waardoor het onmogelijk wordt om MT’s of oplosbare tubuline in weefsels zoals de hersenen te kwantificeren. Bijgevolg is het evalueren van MT-stabiliteit in organismen onder fysiologische en pathologische omstandigheden een uitdaging gebleken. Om deze experimentele beperking aan te pakken, hebben we een nieuwe techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig scheiden van MT’s en vrije tubuline in muizenweefsel²³.

Deze unieke MT-fractioneringsmethode omvat weefselhomogenisatie onder omstandigheden die de tubulinestatus in weefsels behouden en centrifugatie in twee stappen om stabiele MT’s, labiele MT’s en vrije tubuline te scheiden. Deze eenvoudige procedure kan worden toegepast op brede studies, waaronder fundamenteel onderzoek naar MT’s en MAP’s in levende organismen, fysiologische en pathologische analyses van gezondheid en ziekten die verband houden met MT-stabiliteit, en het ontwikkelen van geneesmiddelen en andere therapieën die gericht zijn op MT’s.