Измерение свойств мембранного периодического скелета начального сегмента аксона с помощью 3D-структурированной микроскопии освещения (3D-SIM)
Summary
Настоящий протокол описывает способ визуализации и измерения актиновых колец и других компонентов мембранного периодического скелета исходного сегмента аксона с использованием культивируемых нейронов гиппокампа крыс и 3D-структурированной микроскопии освещения (3D-SIM).
Abstract
Начальный сегмент аксона (AIS) является местом, на котором инициируются потенциалы действия, и представляет собой транспортный фильтр и диффузионный барьер, которые способствуют поддержанию полярности нейронов путем сортировки сомато-дендритного груза. Мембранный периодический скелет (MPS), содержащий периодические актиновые кольца, обеспечивает каркас для закрепления различных белков AIS, включая структурные белки и различные ионные каналы. Хотя недавние протеомные подходы выявили значительное число новых компонентов АИС, детали структуры MPS и роли его отдельных компонентов отсутствуют. Расстояние между отдельными актиновыми кольцами в MPS (~ 190 нм) требует использования методов микроскопии сверхвысокого разрешения для разрешения структурных деталей MPS. Этот протокол описывает метод использования культивируемых нейронов гиппокампа крыс для изучения точной локализации белка AIS в MPS относительно субмембранозных актиновых колец с использованием 3D-структурированной микроскопии освещения (3D-SIM). Кроме того, описан аналитический подход к количественной оценке периодичности отдельных компонентов и их положения относительно актиновых колец.
Introduction
Начальный сегмент аксона (АИС) представляет собой короткую, уникально специализированную область проксимального аксона нейронов позвоночных1. АИС содержит транспортный фильтр и диффузионный барьер, необходимые для поддержания полярности нейронов путем сортировки сомато-дендритного груза2,3,4,5,6,7. Кроме того, уникальная структура АИС позволяет размещать кластеры ионных каналов с напряжением, которые облегчают его функцию в качестве места инициации потенциала действия8. Высокостабильный структурный комплекс лежит в основе уникальных функций АИС. Исследования в течение последнего десятилетия выявили наличие мембранного периодического скелета (MPS), содержащего актиновые кольца, соединенные спектрином и обеспечивающие каркас для закрепления различных белков AIS9,10.
Расстояние между актиновыми кольцами в MPS (~190 нм)9,10 находится под пределом разрешения обычной световой микроскопии. Ранние попытки использовать электронную микроскопию для визуализации MPS не увенчались успехом, поскольку жесткие процедуры подготовки не смогли сохранить структуру MPS. Таким образом, методы микроскопии со сверхвысоким разрешением оказались бесценными в выяснении некоторых структурных деталей MPS11. Однако понимание структурного комплекса АИС, идентичности и функций его компонентов, его пространственно-временной регуляции до сих пор является неполным. Недавние протеомные исследования преуспели в создании значительного списка белков, которые локализуются в АИС вблизи структурных компонентов AIS12,13. Тем не менее, детали их функции и точное место в комплексе АИС отсутствуют. Таким образом, методы микроскопии со сверхвысоким разрешением служат важным инструментом для изучения точных положений этих белков относительно других компонентов MPS и исследования их функций. Несколько методов световой микроскопии могут достигать разрешений выше, чем дифракционный предел света, некоторые даже способны локализовать отдельные молекулы. Однако многие из этих методов обычно требуют специализированных флуорофоров или буферов визуализации, а получение изображений часто занимает много времени14.
3D-структурированная микроскопия освещения (3D-SIM), благодаря простоте использования и простым требованиям к пробоподготовке, не требует специальных реагентов для визуализации или подготовки образцов, хорошо работает с широким спектром флуорофоров и образцов, может быть легко реализована в нескольких цветах и способна к визуализации живых клеток15. Хотя наилучшее возможное разрешение SIM-карты (~ 120 нм) является низким по сравнению со многими другими методами сверхразрешения, его достаточно для многих приложений (например, для разрешения компонентов MPS в нейронах). Таким образом, крайне важно учитывать требования к конкретным приложениям, чтобы определить, является ли SIM-карта подходящим выбором или необходимо еще более высокое разрешение. Здесь описан протокол использования культивируемых нейронов гиппокампа и 3D-структурированной микроскопии освещения (3D-SIM) для изучения положения и организации предполагаемых белков АИС относительно актиновых колец в MPS, как реализовано в Abouelezz et al.16
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, предоставляет метод визуализации и измерения белков MPS с использованием метода сверхвысокого разрешения. Поскольку актиновые кольца и другие компоненты MPS демонстрируют периодичность ~ 190 нм9,10, обычные дифракционные подходы к …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Д-р Пирта Хотулайнен отмечена за ее критические комментарии, неоценимые для подготовки этой рукописи. Доктор Риманте Минкявичене признана за ее помощь в подготовке нейронных культур, используемых для оригинальных экспериментов. Вся визуализация проводилась в отделении визуализации биомедицины. Эта работа была поддержана Академией Финляндии (D.M., SA 266351) и докторской программой Brain & Mind (A.A.)
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer’s disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
