Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM)
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om actineringen en andere componenten van het periodieke membraanskelet van het axoninitiële segment te visualiseren en te meten met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ratten en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM).
Abstract
Het axoninitiesegment (AIS) is de plaats waar actiepotentialen initiëren en vormt een transportfilter en diffusiebarrière die bijdragen aan het behoud van neuronale polariteit door somato-dendritische lading te sorteren. Een membraan periodiek skelet (MPS) bestaande uit periodieke actineringen biedt een steiger voor het verankeren van verschillende AIS-eiwitten, waaronder structurele eiwitten en verschillende ionkanalen. Hoewel recente proteomische benaderingen een aanzienlijk aantal nieuwe AIS-componenten hebben geïdentificeerd, ontbreken details over de structuur van de MPS en de rollen van de afzonderlijke componenten ervan. De afstand tussen individuele actineringen in de MPS (~ 190 nm) vereist het gebruik van superresolutiemicroscopietechnieken om de structurele details van de MPS op te lossen. Dit protocol beschrijft een methode voor het gebruik van gekweekte hippocampusneuronen van ratten om de precieze lokalisatie van een AIS-eiwit in de MPS ten opzichte van sub-vliezige actineringen te onderzoeken met behulp van 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM). Daarnaast wordt ook een analytische benadering beschreven om de periodiciteit van individuele componenten en hun positie ten opzichte van actineringen kwantitatief te beoordelen.
Introduction
Het axon initial segment (AIS) is een kort, uniek gespecialiseerd gebied van het proximale axon van gewervelde neuronen1. De AIS omvat een transportfilter en diffusiebarrière die essentieel zijn voor het behoud van neuronale polariteit door somato-dendritische lading te sorteren2,3,4,5,6,7. Bovendien maakt de unieke structuur van het AIS het mogelijk om clusters van spanningsafhankelijke ionkanalen te huisvesten die zijn functie als de plaats van actiepotentiaalinitiatie vergemakkelijken8. Een zeer stabiel structureel complex ligt ten grondslag aan de unieke functies van het AIS. Onderzoek in het afgelopen decennium heeft de aanwezigheid aangetoond van een membraan periodiek skelet (MPS) met actineringen verbonden door spectrine en een steiger voor het verankeren van verschillende AIS-eiwitten9,10.
De afstand tussen actineringen in de MPS (~190 nm)9,10 ligt onder de resolutiegrens van conventionele lichtmicroscopie. Vroege pogingen om elektronenmicroscopie te gebruiken om de MPS te visualiseren waren niet succesvol, omdat de zware voorbereidingsprocedures die ermee gepaard gingen, de structuur van de MPS niet konden behouden. Superresolutiemicroscopietechnieken zijn dus van onschatbare waarde gebleken bij het ophelderen van enkele van de structurele details van de MPS11. Het begrip van het structurele AIS-complex, de identiteit en functies van de componenten en de spatiotemporele regulatie zijn echter nog steeds onvolledig. Recente proteomische studies zijn erin geslaagd om een aanzienlijke lijst van eiwitten te creëren die zich lokaliseren naar de AIS dicht bij structurele componenten van de AIS12,13. Toch ontbreken details over hun functie en precieze plaats in het AIS-complex. Superresolutiemicroscopietechnieken dienen dus als een essentieel hulpmiddel om de nauwkeurige posities van deze eiwitten ten opzichte van andere MPS-componenten te onderzoeken en hun functies te onderzoeken. Verschillende lichtmicroscopietechnieken kunnen resoluties bereiken die hoger zijn dan de diffractielimiet van licht, sommige zelfs in staat om afzonderlijke moleculen te lokaliseren. Veel van deze technieken vereisen echter meestal gespecialiseerde fluoroforen of beeldbuffers en beeldacquisitie is vaak tijdsintensief14.
3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM), vanwege het gebruiksgemak en de eenvoudige vereisten voor monstervoorbereiding, vereist geen speciale reagentia voor beeldvorming of monstervoorbereiding, werkt goed met een breed scala aan fluoroforen en monsters, kan gemakkelijk in meerdere kleuren worden geïmplementeerd en is in staat tot live-cell imaging15. Hoewel de best mogelijke resolutie die SIM biedt (~ 120 nm) laag is in vergelijking met veel andere superresolutietechnieken, is het voldoende voor veel toepassingen (bijvoorbeeld voor het oplossen van de componenten van de MPS in neuronen). Het is dus van cruciaal belang om rekening te houden met de vereiste voor specifieke toepassingen om te bepalen of SIM een geschikte keuze is of dat een nog hogere resolutie nodig is. Hier wordt een protocol beschreven voor het gebruik van gekweekte hippocampusneuronen en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM) om de positie en organisatie van vermeende AIS-eiwitten ten opzichte van actineringen in de MPS te onderzoeken, zoals geïmplementeerd in Abouelezz et al.16
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol biedt een methode voor het visualiseren en meten van MPS-eiwitten met behulp van de superresolutietechniek. Aangezien actineringen en andere MPS-componenten een periodiciteit van ~190 nm9,10 vertonen, kunnen conventionele diffractiebeperkte beeldvormingsbenaderingen de details van de MPS niet onthullen. Verschillende microscopie-opstellingen kunnen diffractie-beperkte structuren in superresolutie oplossen, en SIM vertegenwoordigt een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pirta Hotulainen wordt erkend voor haar kritische opmerkingen, van onschatbare waarde voor het voorbereiden van dit manuscript. Dr. Rimante Minkeviciene wordt erkend voor haar hulp bij het voorbereiden van de neuronale culturen die werden gebruikt voor de oorspronkelijke experimenten. Alle beeldvorming werd uitgevoerd in de Biomedicum Imaging Unit. Dit werk werd ondersteund door de Academy of Finland (D.M., SA 266351) en doctoraatsprogramma Brain & Mind (A.A.)
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer’s disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
