3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

軸索初期セグメント(AIS)は、脊椎動物ニューロンの近位軸索の短く、一意に専門化された領域^である1。AISは、ソマト樹状貨物2,3,4,5,6,7を選別することにより、ニューロン極性の維持に不可欠な輸送フィルターと拡散バリアを備える。さらに、AISのユニークな構造により、活動電位開始部位としての機能を容易にする電位依存性イオンチャネルのクラスターを収容することができます⁸。非常に安定した構造複合体は、AISのユニークな機能の根底にあります。過去10年間の研究により、スペクトリンによって接続されたアクチン環を含む膜周期骨格(MPS)の存在が明らかになり、さまざまなAISタンパク質を固定するための足場が提供されました^9,10。

MPS(〜190nm)^9,10におけるアクチン環間の距離は、従来の光学顕微鏡の分解能限界以下である。電子顕微鏡を使用してMPSを視覚化しようとする初期の試みは、MPSの構造を保存するのに失敗したため、失敗した。したがって、超解像顕微鏡技術は、^MPS11の構造の詳細のいくつかを解明する上で非常に貴重であることが証明されています。しかし、AIS構造複合体、その構成要素の同一性と機能、およびその時空間調節の理解はまだ不完全である。最近のプロテオミクス研究は、AISの構造成分に近いAISに局在するタンパク質のかなりのリストを作成することに成功しました^12,13。それでも、AIS複合体におけるそれらの機能の詳細と正確な位置は欠けています。したがって、超解像顕微鏡技術は、他のMPS成分に対するこれらのタンパク質の正確な位置を調べ、それらの機能を調べるために不可欠なツールとして役立つ。いくつかの光学顕微鏡技術は、光の回折限界よりも高い分解能を達成することができ、いくつかは単一分子を局在化させることさえできる。しかし、これらの技術の多くは、通常、特殊な蛍光色素またはイメージングバッファーを必要とし、画像取得にはしばしば時間がかかります¹⁴。

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)は、その使いやすさと簡単なサンプル調製要件により、イメージングやサンプル調製のための特別な試薬を必要とせず、幅広い蛍光色素やサンプルでうまく動作し、複数の色で容易に実装でき、生細胞イメージングが可能です¹⁵。SIMが提供する可能な限り最高の解像度(〜120nm)は、他の多くの超解像技術と比較して低いが、多くのアプリケーション(例えば、ニューロン内のMPSの成分を解像する)には十分である。したがって、SIMが適切な選択肢であるかどうか、またはさらに高い解像度が必要かどうかを判断するために、特定のアプリケーションの要件を考慮することが重要です。ここでは、Abouelezzらで実施されているように、培養海馬ニューロンおよび3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を使用して、MPSにおけるアクチン環に対する推定AISタンパク質の位置および組織を調べるためのプロトコルが記載されている¹⁶。