Messung der Eigenschaften des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM)
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung und Messung von Aktinringen und anderen Komponenten des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM).
Abstract
Das Axon-Anfangssegment (AIS) ist der Ort, an dem Aktionspotentiale ausgehen und bildet einen Transportfilter und eine Diffusionsbarriere, die zur Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität beitragen, indem sie somato-dendritische Fracht sortieren. Ein periodisches Membranskelett (MPS), das aus periodischen Aktinringen besteht, bietet ein Gerüst zur Verankerung verschiedener AIS-Proteine, einschließlich Strukturproteinen und verschiedener Ionenkanäle. Obwohl neuere proteomische Ansätze eine beträchtliche Anzahl neuartiger AIS-Komponenten identifiziert haben, fehlen Details über die Struktur des MPS und die Rollen seiner einzelnen Komponenten. Der Abstand zwischen einzelnen Aktinringen im MPS (~ 190 nm) erfordert den Einsatz von hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die strukturellen Details des MPS aufzulösen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Verwendung kultivierter Hippocampus-Neuronen von Ratten, um die genaue Lokalisation eines AIS-Proteins im MPS relativ zu submembranösen Aktinringen mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM) zu untersuchen. Darüber hinaus wird ein analytischer Ansatz beschrieben, um die Periodizität einzelner Komponenten und ihre Position relativ zu Aktinringen quantitativ zu beurteilen.
Introduction
Das Axon-Anfangssegment (AIS) ist eine kurze, einzigartig spezialisierte Region des proximalen Axons von Wirbeltierneuronen1. Das AIS umfasst einen Transportfilter und eine Diffusionsbarriere, die für die Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität durch Sortierung somato-dendritischer Fracht2,3,4,5,6,7 unerlässlich sind. Darüber hinaus ermöglicht die einzigartige Struktur des AIS, Cluster von spannungsgesteuerten Ionenkanälen unterzubringen, die seine Funktion als Ort der Initiierung von Aktionspotentialen erleichtern8. Den einzigartigen Funktionen des AIS liegt ein hochstabiler Strukturkomplex zugrunde. Die Forschung in den letzten zehn Jahren hat das Vorhandensein eines periodischen Membranskeletts (MPS) gezeigt, das Aktinringe enthält, die durch Spektrin verbunden sind und ein Gerüst für die Verankerung verschiedener AIS-Proteine bieten9,10.
Der Abstand zwischen den Aktinringen im MPS (~190 nm)9,10 liegt unter der Auflösungsgrenze der herkömmlichen Lichtmikroskopie. Frühe Versuche, die Elektronenmikroskopie zur Visualisierung des MPS zu verwenden, waren nicht erfolgreich, da die harten Vorbereitungsverfahren die Struktur des MPS nicht erhalten konnten. Daher haben sich hochauflösende Mikroskopietechniken als von unschätzbarem Wert erwiesen, um einige der strukturellen Details des MPS11 zu erläutern. Das Verständnis des AIS-Strukturkomplexes, der Identität und Funktionen seiner Komponenten und seiner räumlich-zeitlichen Regulation ist jedoch noch unvollständig. Jüngsten proteomischen Studien gelang es, eine beträchtliche Liste von Proteinen zu erstellen, die in der Nähe von Strukturkomponenten des AIS lokalisiert sind12,13. Dennoch fehlen Details zu ihrer Funktion und ihrem genauen Platz im AIS-Komplex. Daher dienen hochauflösende Mikroskopietechniken als wesentliches Werkzeug, um die genauen Positionen dieser Proteine relativ zu anderen MPS-Komponenten zu untersuchen und ihre Funktionen zu untersuchen. Mehrere Lichtmikroskopietechniken können Auflösungen erreichen, die über der Beugungsgrenze des Lichts liegen, einige sind sogar in der Lage, einzelne Moleküle zu lokalisieren. Viele dieser Techniken erfordern jedoch in der Regel spezielle Fluorophore oder Bildgebungspuffer, und die Bildaufnahme ist oft zeitintensiv14.
Die strukturierte 3D-Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM) erfordert aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit und einfachen Anforderungen an die Probenvorbereitung keine speziellen Reagenzien für die Bildgebung oder Probenvorbereitung, funktioniert gut mit einer Vielzahl von Fluorophoren und Proben, kann problemlos in mehreren Farben implementiert werden und ist in der Lage, Live-Cell-Imaging zu erstellen15. Während die bestmögliche Auflösung der SIM-Karte (~ 120 nm) im Vergleich zu vielen anderen Super-Resolution-Techniken niedrig ist, ist sie für viele Anwendungen ausreichend (z. B. zum Auflösen der Komponenten des MPS in Neuronen). Daher ist es wichtig, die Anforderung für bestimmte Anwendungen zu berücksichtigen, um festzustellen, ob SIM eine geeignete Wahl ist oder ob eine noch höhere Auflösung erforderlich ist. Hier wird ein Protokoll zur Verwendung von kultivierten Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM) beschrieben, um die Position und Organisation von mutmaßlichen AIS-Proteinen relativ zu Aktinringen im MPS zu untersuchen, wie es in Abouelezz et al.16 implementiert ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine Methode zur Visualisierung und Messung von MPS-Proteinen mit der Super-Resolution-Technik. Da Aktinringe und andere MPS-Komponenten eine Periodizität von ~190 nm9,10 aufweisen, können herkömmliche beugungsbegrenzte Bildgebungsansätze die Details des MPS nicht offenbaren. Mehrere Mikroskopie-Setups können beugungsbegrenzte Strukturen in Superauflösung auflösen, und SIM stellt eine robuste und unkomplizierte Option…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pirta Hotulainen wird für ihre kritischen Kommentare gewürdigt, die für die Vorbereitung dieses Manuskripts von unschätzbarem Wert sind. Dr. Rimante Minkeviciene ist für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der neuronalen Kulturen bekannt, die für die ursprünglichen Experimente verwendet wurden. Die gesamte Bildgebung wurde in der Biomedicum Imaging Unit durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Akademie von Finnland (D.M., SA 266351) und dem Doktorandenprogramm Brain & Mind (A.A.) unterstützt.
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
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