Akson Başlangıç Segmentinin Membran Periyodik İskeletinin 3D Yapılı Aydınlatma Mikroskobu (3D-SIM) Kullanılarak Ölçüm Özellikleri
Summary
Bu protokol, kültürlü sıçan hipokampal nöronları ve 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) kullanarak aktin halkalarını ve akson başlangıç segmentinin membran periyodik iskeletinin diğer bileşenlerini görselleştirmek ve ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.
Abstract
Akson başlangıç segmenti (AIS), aksiyon potansiyellerinin başladığı ve somato-dendritik kargoyu ayırarak nöronal polaritenin korunmasına katkıda bulunan bir taşıma filtresi ve difüzyon bariyeri oluşturduğu yerdir. Periyodik aktin halkalarından oluşan bir membran periyodik iskeleti (MPS), yapısal proteinler ve farklı iyon kanalları da dahil olmak üzere çeşitli AIS proteinlerinin sabitlenmesi için bir iskele sağlar. Son proteomik yaklaşımlar önemli sayıda yeni AIS bileşeni tanımlamış olsa da, MPS’nin yapısına ve bireysel bileşenlerinin rollerine ilişkin ayrıntılar eksiktir. MPS’deki (~190 nm) münferit aktin halkaları arasındaki mesafe, MPS’nin yapısal ayrıntılarını çözmek için süper çözünürlüklü mikroskopi tekniklerinin kullanılmasını gerektirmektedir. Bu protokol, 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) kullanılarak MPS’deki bir AIS proteininin submembranöz aktin halkalarına göre hassas lokalizasyonunu incelemek için kültürlenmiş sıçan hipokampal nöronlarının kullanılmasına yönelik bir yöntemi açıklamaktadır. Ek olarak, bireysel bileşenlerin periyodikliğini ve aktin halkalarına göre konumlarını nicel olarak değerlendirmek için analitik bir yaklaşım da açıklanmaktadır.
Introduction
Akson başlangıç segmenti (AIS), omurgalı nöronlarının proksimal aksonunun kısa, benzersiz bir şekilde uzmanlaşmış bir bölgesidir1. AIS, somato-dendritik kargoyu sıralayarak nöronal polariteyi korumak için gerekli olan bir taşıma filtresi ve difüzyon bariyerini içerir2,3,4,5,6,7. Ek olarak, AIS’nin benzersiz yapısı, aksiyon potansiyeli başlatma yeri olarak işlevini kolaylaştıran voltaj kapılı iyon kanalları kümelerini barındırmasına izin verir8. AIS’nin benzersiz işlevlerinin altında son derece kararlı bir yapısal kompleks yatmaktadır. Son on yılda yapılan araştırmalar, spektrin ile bağlanmış aktin halkaları içeren ve çeşitli AIS proteinlerini sabitlemek için bir iskele sağlayan bir membran periyodik iskeletinin (MPS) varlığını ortaya koymuştur9,10.
MPS (~190 nm)9,10’daki aktin halkaları arasındaki mesafe, geleneksel ışık mikroskobunun çözünürlük sınırının altındadır. MPS’yi görselleştirmek için elektron mikroskobu kullanmaya yönelik ilk girişimler, söz konusu sert hazırlık prosedürleri MPS’nin yapısını koruyamadığından başarılı olamamıştır. Bu nedenle, süper çözünürlüklü mikroskopi tekniklerinin, MPS11’in bazı yapısal ayrıntılarını aydınlatmada paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, AIS yapısal kompleksinin anlaşılması, bileşenlerinin kimliği ve işlevleri ve mekansal zamansal düzenlemesi hala tamamlanmamıştır. Son proteomik çalışmalar, AIS12,13’ün yapısal bileşenlerine yakın AIS’ye lokalize olan proteinlerin büyük bir listesini oluşturmayı başardı. Yine de, işlevlerinin ayrıntıları ve AIS kompleksindeki kesin yerleri eksiktir. Bu nedenle, süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri, bu proteinlerin diğer MPS bileşenlerine göre doğru konumlarını incelemek ve işlevlerini araştırmak için gerekli bir araç görevi görür. Birkaç ışık mikroskobu tekniği, ışığın kırınım sınırından daha yüksek çözünürlükler elde edebilir, hatta bazıları tek molekülleri lokalize edebilir. Bununla birlikte, bu tekniklerin çoğu tipik olarak özel floroforlar veya görüntüleme tamponları gerektirir ve görüntü elde etmek genellikle zaman alıcıdır14.
3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM), kullanım kolaylığı ve basit numune hazırlama gereksinimleri nedeniyle, görüntüleme veya numune hazırlama için özel bir reaktif gerektirmez, çok çeşitli floroforlar ve numunelerle iyi çalışır, birden fazla renkte kolayca uygulanabilir ve canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahiptir15. Mümkün olan en iyi çözünürlüklü SIM teklifleri (~120 nm) diğer birçok süper çözünürlüklü tekniğe kıyasla düşük olsa da, birçok uygulama için yeterlidir (örneğin, MPS’nin nöronlardaki bileşenlerini çözmek için). Bu nedenle, SIM’in uygun bir seçim olup olmadığını veya daha yüksek bir çözünürlüğün gerekli olup olmadığını belirlemek için belirli uygulamaların gerekliliğini göz önünde bulundurmak çok önemlidir. Burada, Abouelezz ve ark.16’da uygulandığı gibi, MPS’deki aktin halkalarına göre varsayılan AIS proteinlerinin konumunu ve organizasyonunu incelemek için kültürlenmiş hipokampal nöronların ve 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobunun (3D-SIM) kullanılmasına yönelik bir protokol açıklanmaktadır.16
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, süper çözünürlük tekniğini kullanarak MPS proteinlerinin görselleştirilmesi ve ölçülmesi için bir yöntem sağlar. Aktin halkaları ve diğer MPS bileşenleri ~190 nm9,10 periyodiklik gösterdiğinden, geleneksel kırınım sınırlı görüntüleme yaklaşımları MPS’nin ayrıntılarını ortaya çıkaramaz. Birkaç mikroskopi kurulumu, kırınım sınırlı yapıları süper çözünürlükte çözebilir ve SIM sağlam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pirta Hotulainen, bu makaleyi hazırlamak için paha biçilmez olan eleştirel yorumları için kabul edilmektedir. Dr. Rimante Minkeviciene, orijinal deneyler için kullanılan nöronal kültürlerin hazırlanmasındaki yardımı için teşekkür edilir. Tüm görüntüleme işlemleri Biomedicum Görüntüleme Ünitesinde yapıldı. Bu çalışma Finlandiya Akademisi (D.M., SA 266351) ve Doktora Programı Beyin ve Zihin (AA) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer’s disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
