מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

כל ההליכים המתוארים במאמר זה בוצעו בהתאם להנחיות של IACUC ו- KU Leuven ובוצעו במסגרת בקשת הפרויקט המאושרת P160/2020. לפני ביצוע פרוטוקול זה, אנא עיין באסטרטגיית משככי הכאבים עם הווטרינר המוסדי ונהל משככי כאבים לפני ואחרי הניתוח בהתאם להנחיות המוסדיות. 1. הכנת ה-R.MIW (תזמון משוער: 2 שעות) הערה: לבניית R.MIW, מומלץ למצוא יצרן מקומי המתמחה בעבודה עם חומרים קשים כגון טיטניום, שכן זה דורש כלים מיוחדים ומומחיות. לסדנאות המתמחות בתכנון וייצור של תותבות טיטניום יש בדרך כלל את המכונות והמומחיות לייצר את חלקי R.MIW. מניחים את המכסה של ה-R.MIW על משטח סטרילי כאשר החלק החיצוני של המכסה פונה כלפי מעלה (וזרועות המכסה משופעות כלפי מטה; איור 1A). יש למרוח דבק ציאנואקרילט סביב כל שפת המכסה ולהניח בזהירות כיסוי זכוכית עגול בקוטר 10 מ”מ על גבי המכסה.הערה: הכן תמיד מכסה רזרבי עם כיסוי זכוכית כגיבוי במהלך ההליך הכירורגי. השתמשו במקל עץ סטרילי כדי למקם את מכסה הזכוכית ולהפעיל כוח מסוים כדי לדחוף אותו כלפי מטה כדי להבטיח אטימה אטומה לאוויר בין מכסה הזכוכית למסגרת המכסה. וודאו שהחורים בזרועות המכסה אינם מכוסים על ידי הזכוכית. יש לחטא את המכסים ואת ה-R.MIW על ידי טבילה ב-80% אתנול למשך 30 דקות לפחות בצלחת פטרי סגורה.הערה: אין להשאיר את המכסים במשך יותר משעה אחת ב-80% אתנול כדי למנוע את פירוק הדבק הציאנואקרילט. הסירו את עודפי דבק הציאנואקרילט מכיסוי הזכוכית באמצעות קצה כותנה ספוג באצטון. אחסנו את המכסים ואת ה-R.MIW בסביבה סטרילית עד לשימוש נוסף.הערה: ניתן לשמור את המסגרת והמכסים של R.MIW בצינור או בשקית סטרילית למשך שבוע לכל היותר. בעת חידוש הניסוי, בדקו תמיד אם מכסה הזכוכית עדיין מחובר כראוי למכסה לפני שתמשיכו בפרוטוקול. 2. הכנה לניתוח (תזמון משוער: 15 דקות) הערה: עבור הליך השתלת R.MIW, ניתן להשתמש בעכברים נקבות (>3.5 שבועות) מכל זן. שמרו על סטריליות על ידי שימוש בכפפות סטריליות, ועקרו את כל הפריטים שיבואו במגע עם העכבר. לשטוף כלי ניתוח עם מים וסבון עדין, אוויר יבש, לעטוף בנייר אלומיניום ללא פינות או קצוות חשופים, ולעקר באמצעות autoclave למחזור של 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. להכין פלטפורמה כירורגית סטרילית ולעקר את המשטחים עם 80% אתנול.הערה: כדי להבטיח עקרות, הניתוח יכול להתבצע בארון זרימה. הפעילו את כרית החימום וכסו את המחצלת בוילון סטרילי. מקבעים את המכשירים הסטריליים על הווילון הסטרילי ומניחים את ה-R.MIW ומינימום של שני מכסים מכוסים זכוכית במי מלח סטריליים עם מאגר פוספט (PBS) בצלחת פטרי (סגרו את המכסה כדי למנוע זיהום חיצוני). הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות תערובת איזופלורן/O2 של 3%. יש לוודא כי החיה רגועה מספיק כדי שניתן יהיה לתמרן אותה בקלות ולהעביר אותה למסכת האף ללא כל מאבק. העבירו את העכבר מתא האינדוקציה למסכת האף להרדמה והפחיתו את רמת האיזופלורן לתערובת איזופלורן ל-1.5% – 2% איזופלורן/O2 . אמת הרדמה מלאה על ידי ביצוע בדיקת גמילה מכפה. כדי לבצע את בדיקת הנסיגה של הכפה, צובטים בחוזקה את כף החיה באמצעות ציפורניים או מלקחיים קהים. בהיעדר כל רפלקס שרירים, לשקול את החיה כמו מחוסר הכרה ולהמשיך להכנה כירורגית. בצע בדיקה זו לפני מניפולציה של בעלי חיים וחזור על הפעולה באופן קבוע במהלך הליכי ההרדמה והניתוחים כדי לאשר הרדמה. יש למרוח משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית. גילחו את האזור סביב בלוטת החלבהרביעית באמצעות סכין גילוח (איור 2A). השתמש בפטמההרביעית כציון דרך. הסר שערות רופפות באמצעות סרט דביק.הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בקרם דפילטור כדי להסיר את השערות. יש לחטא את העור החשוף ב-80% אתנול או פובידון-יוד ולמקם את העכבר באזור הניתוחי הסטרילי בגבו עם החוטם למסכת אף הרדמה באמצעות תערובת איזופלורן/O2 של 1.5%. אבטח את הגפיים הקדמיות והאחוריות של העכבר באמצעות נייר דבק.הערה: השאירו את העכבר המרדים והמחלים על משטח החימום ככל האפשר, במהלך הניתוח ולאחריו. השתמשו בוילון כירורגי סטרילי מקדים או גזה כדי לכסות את העכבר תוך השארת האזור הכירורגי חשוף. 3. השתלת R.MIW (תזמון משוער: 30 דקות) ודא אם החיה מורדמת כראוי על ידי ביצוע בדיקת גמילה מכפות. הרימו את העור בעדינות באמצעות מלקחיים עדינים של Graefe ובצעו חתך אלכסוני בקוטר 10-15 מ”מ באמצעות מספריים קפיציים קטנים בעור על גבי כרית השומן של החלבהרביעית תוך שימוש בפטמהה-4 כנקודת כיוון (איור 2A). הקפידו לא לחתוך או לפגוע בצפק או בבלוטת החלב. הגדר את אזור העניין (ROI) בהתבסס על תכונות מקרוסקופיות של רקמת החלב, כולל מיקום בלוטת הלימפה או נגע הגידול, ונסה לשמור על ROI מרכזי ביחס לחתך. הפרד את העור מכרית השומן של החלב ואת שכבות הרקמה שמתחתיו באמצעות כריתה קהה של עד 5-8 מ”מ סביב קו החתך כדי ליצור כיס שיתאים למסגרת R.MIW (איור 2BI). הרימו את ה-R.MIW באמצעות מלקחיים סטריליים ובדקו אם החתך גדול מספיק כדי להכניס את החלון. במידת הצורך, הגדל מעט את החתך עד שה- R.MIW ישתלב. הסר את ה- R.MIW והנח תפר מיתר ארנק סביב החתך באמצעות תפר משי 5-0 (קלוע, לא ניתן לספיגה). מניחים את התפר 1-2 מ”מ מקצה החתך מבחוץ אל פנים העור, החל מהקצה הקאודלי של החתך. נעים כ-5 מ”מ למעלה לאורך החתך ומעבירים את חוט התפר דרך העור מבפנים לחוץ. חזור על הליך זה לאורך קצה החתך, ובכך צור תפר מעגלי המורכב מ-5-6 לולאות (איור 2BII). היציאה הסופית של חוט התפר צריכה להיות ממוקמת במרחק של כ-2-5 מ”מ מהכניסה הראשונה.הערה: היזהרו שלא למקם את התפר קרוב מדי לקצה החתך, מכיוון שהדבר מגביר את הסיכון לקרע בעור. הצבת התפר רחוק מדי מקצה החתך מגבירה את הסיכון לזיהום בין עודפי העור לחריץ של R.MIW. התאם את ה- R.MIW בתוך החתך והשתמש במלקחיים של Graefe כדי למקם בזהירות את העור בחריץ של ה- R.MIW. הקפידו להשאיר את הלולאות של התפר בחוץ. משכו את הלולאות של תפר הארנק והידקו את התפר בחריץ של ה-R.MIW על ידי משיכה עדינה בשני קצות התפר (איור 2BIII). קשרו קשרים כירורגיים וחתכו את החוט העודף. יש למרוח ג’לי נפט על השפה הפנימית של ה-R.MIW באמצעות קיסם, תוך הקפדה על הימנעות מהרקמה שמתחתיה. דחפו בעדינות את מסגרת החלון כלפי מטה עם מלקחיים סטריליים או שתי קצות אצבעות, והניחו את המכסה לתוך מסגרת R.MIW (איור 1B). זה ימנע נפח של אוויר בין רקמת בלוטת החלב למכסה R.MIW. מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך החורים בזרועות המכסה ומהדקים את המכסה על ידי סיבוב המכסה בכיוון השעון (בערך 5°) (איור 1C ואיור 2BIV). אם נשאר מעט אוויר לאחר הידוק מכסה ה-R.MIW, השתמשו במחט אינסולין סטרילית כדי להסיר את עודפי האוויר. מכניסים את המחט דרך העור לתוך החלל שבין רקמת החלב למכסה ושולפים באיטיות את הבוכנה, ובכך יוצרים ואקום בין רקמת בלוטת החלב למכסה R.MIW. מתן, לאחר ניתוח, משכך כאבים כגון buprenorphine (0.1 מ”ג / ק”ג מדולל סטרילי 0.9% NaCl) על ידי הזרקה תת עורית. יש לחזור על הזרקה תת עורית עם בופרנורפין ב-8 שעות ו-16 שעות לאחר הניתוח. החזירו את העכבר לכלוב כדי להתאושש ולנטר מקרוב עד שהוא ער לחלוטין, או המשיכו עם שלב 4 להדמיה מיידית. בשלב זה שלאחר הניתוח, עקוב מקרוב אחר העכברים לאיתור סימנים של אי נוחות או סיבוכים בהתבסס על פרמטרים חיוניים, כגון נשימה, תגובתיות, התנהגות, יציבה ומשקל גוף. עקוב בקפידה אחר העור המקיף את החלון לאיתור סימנים של דלקת ונמק. אם לא יתרחשו סיבוכים, ה-R.MIW יאפשר מפגשי IVM חוזרים ונשנים במשך מספר שבועות לאחר ההשתלה. איור 2: סקירה כללית של ההליך הכירורגי והשתלת החלון. (A) חתך אלכסוני נעשה ליד הפטמההרביעית של עכבר נקבה, והעור והרקמה שמתחתיה מנותקים על ידי דיסקציה קהה. (B) ניתן להשתמש בבלוטת הלימפה המפשעתית ובצורה של כרית השומן עבור הכיוון הנכון של הרקמה (I). תפר מיתר ארנק ממוקם בעור סביב החתך (II), ולאחר התאמת מסגרת החלון, התפר מהודק בחריץ כדי לאבטח את מסגרת החלון, ומאובטח על ידי קשרים כירורגיים (III). השלב האחרון הוא החדרה ונעילה של המכסה לתוך מסגרת החלון (IV). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 4. מיקרוסקופיה תוך-ורידית חוזרת ונשנית באמצעות R.MIW הערה: אסטרטגיית IVM החוזרת על עצמה שתוארה כאן הותאמה למערכת קונפוקלית מרובת פוטונים הפוכה המצוידת בשלב ממונע ותא אקלים כהה בטמפרטורה של 35 °C (64 °F). הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות תערובת איזופלורן/O2 של 3%. אמת אובדן הכרה על ידי ביצוע בדיקת נסיגה מכפה (המתוארת בשלב 2.6). יש למרוח משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית במהלך ההדמיה. בדוק את מצב המסגרת והמכסה של R.MIW, כולל יציבות התפרים או כל נזק פוטנציאלי למכסה. במקרה של נזק למכסה, ניתן להחליף את המכסה כמתואר בשלב 5. העבירו את העכבר לתיבת הדמיה מותאמת אישית (איור 3A) שחוממה מראש (37 מעלות צלזיוס) והניחו את העכבר עם הראש לתוך חרוט האף. תיבת ההדמיה מורכבת ממסגרת שמתאימה לשלב האוטומטי של המיקרוסקופ. המסגרת נועדה להכיל שיבוץ בהתאמה אישית עם חור בקוטר של R.MIW (איור 3A) . מפרצון עם חרוט אף מחובר לקדמת הקופסה ומחובר לתחנת אידוי איזופלורן באמצעות תערובת איזופלורן/O 2%-3% איזופלורן/O2. שקע מחובר ליחידת נבלות הרדמה כדי להבטיח סירקולציה ולמנוע הצטברות של איזופלורן בתיבה. ניתן לסגור את תיבת ההדמיה באמצעות מכסה שקוף. מקם את העכבר על השיבוץ באופן כזה שה-R.MIW נופל בחור של שיבוץ תיבת ההדמיה (איור 3A). יש למרוח פרפילם וסרט נייר על גב העכבר כדי לייצב את העכבר ולהפחית את תנועת הרקמה עקב הנשימה. סגור את תיבת ההדמיה עם המכסה והכנס את תיבת ההדמיה לשלב המיקרוסקופ. הפחיתו את מינון האיזופלורן בהדרגה במהלך סשן ההדמיה כדי לקיים הרדמה יציבה אך שטחית (בדרך כלל בין 1.5%-0.8% תערובת איזופלורן/O2 ). ספק תזונה נכונה במהלך ההדמיה כמתואר להלן. למפגשי הדמיה <3 שעות, יש להזריק לעכבר באופן תת עורי 200-300 μL של PBS סטרילי להידרציה. עבור הפעלות הדמיה >3 שעות, בצע את השלבים המפורטים להלן. להדמיה ארוכת טווח, החדירו לעכבר חומרים מזינים. לשם כך, השתמש בתערובת החדרה סטרילית זמינה מסחרית המכילה חומצות אמינו וגלוקוז. מניחים מחט גמישה באופן תת עורי בצווארו של העכבר ומהדקים אותה בנייר דבק. חברו מזרק של 10 מ”ל עם תערובת החומרים המזינים המוכנים לצינור סיליקון גמיש ודחפו את תערובת החומרים המזינים עד שהיא מגיעה לקצה הצינור. חבר את צינור הסיליקון למחט הגמישה. קחו את קצה הצינורות והניחו אותו דרך אחד החורים של תיבת ההדמיה (מבפנים לחוץ, והשאירו את צד חיבור המחט בתיבה). הזריקו 50 μL של תמיסת החדרה כל 30 דקות. אבטח את תיבת ההדמיה בשלב המיקרוסקופ והגדר את אזור העניין באמצעות מצב האפיפלואורסצנציה של המיקרוסקופ. החל את הגדרות המיקרוסקופ הרצויות בהתאם למודל העכבר (איור 3B). מבני כלי שיט, דפוסי קולגן (שהודמיינו על ידי דור הרמוני שני) ומבנים אנטומיים יציבים אחרים, כולל בלוטת הלימפה המפשעתית, עשויים לשמש כציוני דרך. השג תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מרובה-פוטון הפוך בעומק של 12 סיביות, ומטרת מים של פי 25 באמצעות גודל מדרגת Z הנע בין 1.0 ל-4.0 מיקרומטר (ערימת z כוללת הנעה בין 150 ל-800 מיקרומטר). החל את ההגדרות הסטנדרטיות הבאות: פורמט 1024 x 1024, מהירות סריקה של 600 הרץ, מצב דו-כיווני. דמיינו את סיבי הקולגן I על ידי ביצוע דור הרמוני שני על ידי שימוש באורך גל עירור של 860 ננומטר וזיהוי ב-425-435 ננומטר. אורכי גל של עירור וגילוי עבור הפלואורופורים השונים מצוינים בטבלה 1. טבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. השתמש בפונקציה הספירלית במצב נווט תוכנת הדמיה כדי ליצור סריקת אריחי סקירה גדולה כדי ליצור מפת ייחוס של הרקמה (איור 3B). הגדר את ה- ROIs בתוך הסקירה הספירלית, הגדר את מישורי Z העליונים והתחתונים כדי לקבוע את מחסנית Z. לחץ על התחל כדי לקבל ערימות Z תלת-ממדיות מפורטות (xyz) או ארבע-ממדיות (xyzt) של הרקמה.הערה: במהלך כל ניסוי ההדמיה יש לעקוב מקרוב אחר העכבר. למפגשי הדמיה ארוכים, מומלץ להשתמש באוקסימטר דופק ובבדיקת טמפרטורה. הנשימה של העכבר צריכה להיות קבועה ובאותו קצב. אם העכבר מתחיל להראות סימנים של גזים, יש להפחית את כמות האיזופלורן. בסוף כל מפגש הדמיה, השאירו את העכבר על משטח חימום עד שהוא ער לחלוטין. אם העכבר מראה סימנים של אי נוחות או ניידות מופחתת, שמור את הכלוב למשך זמן רב יותר על כרית החימום וספק ג’לים מזינים במקום צ’או הרגיל.הערה: בין מפגשי הדמיה, העכבר צריך להיות במעקב צמוד אחר סימנים של אי נוחות כגון צריכת מזון ומים מופחתת, נשימה מהירה, ירידה בתנועה, רעד, תנוחת גוף חריגה או פרווה לא מטופחת. במקרה של סימנים ברורים של אי נוחות, יש לעקוב אחר ההנחיות המוסדיות בנוגע לרווחת בעלי החיים ולסיים את הניסוי כאשר נקודת הקצה ההומאנית מגיעה. חזור על שלבים 4.1-4.12 עבור כל הפעלת הדמיה חוזרת והשתמש באריחי הסקירה כדי לשחזר את אותם מיקומים על פני נקודות זמן מרובות (איור 3B). תדירות ההדמיה תהיה תלויה בשאלת המחקר ובתזמון התהליך הנחקר, ובדרך כלל משתנה ממפגשי הדמיה פעמיים ביום לפעם בשבוע. בסוף תקופת הניסוי הרצויה, להרדים את בעלי החיים עם R.MIW מושתל באמצעות הרדמה עמוקה עם איזופלורן ואחריו פריקה צוואר הרחם. אם תרצה, לנתח את האיברים המעניינים לניתוחים נוספים של ex vivo . לחלופין, שמרו על החיה בחיים לצורך ניתוחים עתידיים של in vivo . במקרה כזה, הסר את תפר השקית המחזיק את ה- R.MIW על ידי חיתוךו עם מספריים קפיץ ונתק בזהירות את טבעת החלון מעור העכבר באמצעות מלקחיים קהים. נקו את שולי העור שהחזיקו בעבר את החלון והמשיכו עם תפר רציף פשוט (חומר נספג, כגון חומצה פוליגליקולית). לאחר סגירת העור, קשרו את חוטי התפר ההתחלתיים והסופים בשני קשרים מרובעים (4 זריקות). כדי למזער איסכמיה רקמתית, הקשרים צריכים להיות רופפים מספיק כדי לאפשר זרימת דם בקצה העור. יש לחטא את הפצע בפובידון-יוד כדי למנוע דלקת ולקדם את ריפוי העור. איור 3: זרימת עבודה של IVM אורכי. (A) תיאור סכמטי של ניסוי IVM טיפוסי בן מספר ימים. (B) הדמיה של אזור סרטני בתוך בלוטת החלב הבוגרת. לפני כל מפגש הדמיה, סריקת אריחי סקירה ברזולוציה נמוכה (פאנל עליון) יכולה להקל על זיהוי האזורים המעניינים במהלך ימי ההדמיה הבאים. ניתן להשתמש בתבנית קולגן I (דור הרמוני שני, מג’נטה), מבנה רקמה ותבניות של תאים המסומנים באופן דיפרנציאלי עם חלבונים פלואורסצנטיים (המתוארים בירוק, צהוב ואדום) כדי לשחזר את אותו אזור רקמה. פסי קנה מידה מייצגים 1 מ”מ (סריקת אריחים סקירה) ו- 100 מיקרומטר (לוחות תחתונים). (C) ייצוג סכמטי של מבנה הכתב R26-קונפטי . לאחר רקומבינציה של קר-רקומבינציה המושרה על ידי טמוקסיפן, הקונפטי בונה רקומבינים סטוכסטיים, וכתוצאה מכך ביטוי של אחד מארבעת הפלואורופורים (nGFP, YFP, RFP או mCFP). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 5. פתיחה וסגירה של המכסה של ה-R.MIW בין מפגשי הדמיה שמרו על סטריליות על ידי שימוש בכפפות סטריליות, ועקרו את כל הפריטים שיבואו במגע עם העכבר. כלי ניתוח אוטוקלאבים לפני הניתוח (ראה שלב 2 לפרטים). הפעילו את כרית החימום וכסו את המחצלת בוילון סטרילי והרדימו את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות תערובת של 3% איזופלורן/O2 . אמת הרדמה נאותה על ידי ביצוע בדיקת רפלקס גמילה מכפות. העבירו את העכבר מתא האינדוקציה למסכת האף להרדמה והפחיתו את רמת האיזופלורן לתערובת איזופלורן/O2 % של 1.5%-2%. מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך החורים בזרועות המכסה ומשחררים את המכסה על ידי סיבוב המכסה נגד כיוון השעון. במידת הצורך, יש למרוח כמה PBS סטרילי מחומם מראש (37 °C) על החלון כדי להקל על התרופפות המכסה. מניחים את המכסה של ה-R.MIW במנה סטרילית עם PBS סטרילי עד לשימוש נוסף. נקו את הכיסוי של המכסה עם דמי-מים ולאחר מכן 80% אתנול. יש לשמור על המכסה ב-PBS סטרילי עד לשימוש נוסף. מנעו מהרקמה החשופה להתייבש על ידי הוספת כמה טיפות של PBS סטרילי לפני השטח של הרקמה. להחיל או להזריק כל חומר או תאים בעלי עניין על הרקמה החשופה, נפח מקסימלי של 50 μL ניתן להשתמש. יש להמתין מספר דקות עד שהנוזל ייספג ברקמה. לחלופין, ניתן לתמרן את הרקמה או למקם אותה מחדש באמצעות מלקחיים סטריליים ובוטה כדי לייעל את תנאי ההדמיה עבור ROIs ספציפיים. יש למרוח ג’לי נפט על השפה הפנימית של ה-R.MIW, תוך הקפדה להימנע מהרקמה הבסיסית. מקם את המכסה לתוך מסגרת R.MIW כמתואר בשלב 3.9, מקם את קצות המלקחיים הדקים דרך החורים בזרועות המכסה, והידק את המכסה על ידי סיבוב המכסה בכיוון השעון (כ-5°).