Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

Todos los procedimientos descritos en este documento se realizaron de acuerdo con las directrices de la IACUC y KU Leuven y se llevaron a cabo en el contexto de la solicitud de proyecto aprobada P160/2020. Antes de ejecutar este protocolo, revise la estrategia de analgesia con el veterinario institucional y administre analgesia pre y postoperatoria según las pautas institucionales. 1. Preparación del R.MIW (tiempo estimado: 2 h) NOTA: Para la construcción del R.MIW, es recomendable encontrar un fabricante local que se especialice en trabajar con materiales duros como el titanio, ya que esto requiere herramientas y experiencia especiales. Los talleres especializados en el diseño y fabricación de prótesis de titanio suelen tener la maquinaria y la experiencia para producir las piezas R.MIW. Coloque la tapa del R.MIW sobre una superficie estéril con el exterior de la tapa hacia arriba (y los brazos de la tapa inclinados hacia abajo; Figura 1A). Aplique pegamento adhesivo de cianoacrilato alrededor de todo el borde de la tapa y coloque cuidadosamente una cubierta de vidrio redonda de 10 mm en la parte superior de la tapa.NOTA: Siempre prepare una tapa de repuesto con una cubierta de vidrio como respaldo durante el procedimiento quirúrgico. Use un palo de madera estéril para colocar la cubierta de vidrio y aplique algo de fuerza para empujarla hacia abajo para garantizar un sello hermético entre la cubierta de vidrio y el marco de la tapa. Asegúrese de que los orificios en los brazos de la tapa no estén cubiertos por el vidrio. Desinfecte las tapas y el R.MIW sumergiéndolo en etanol al 80% durante al menos 30 min en una placa de Petri cerrada.NOTA: No deje las tapas por más de 1 h en etanol al 80% para evitar la disolución del pegamento adhesivo de cianoacrilato. Retire el exceso de pegamento adhesivo de cianoacrilato de la cubierta de vidrio usando una punta de algodón empapada en acetona. Guarde las tapas y el R.MIW en un ambiente estéril hasta su uso posterior.NOTA: El marco y las tapas R.MIW se pueden mantener en un tubo o bolsa estéril durante un máximo de 1 semana. Al reanudar el experimento, siempre examine si la cubierta de vidrio todavía está correctamente unida a la tapa antes de continuar con el protocolo. 2. Preparación para la cirugía (tiempo estimado: 15 min) NOTA: Para el procedimiento de implantación de R.MIW, se pueden utilizar ratones hembra (>3,5 semanas de edad) de cualquier cepa. Mantenga la esterilidad mediante el uso de guantes estériles y esterilice todos los artículos que entren en contacto con el ratón. Lave las herramientas quirúrgicas con agua y jabón suave, seque al aire, envuelva en papel de aluminio sin esquinas ni bordes expuestos y esterilice con un autoclave durante un ciclo de 20 minutos a 120 ° C antes de la cirugía. Preparar una plataforma quirúrgica estéril y esterilizar las superficies con etanol al 80%.NOTA: Para garantizar la esterilidad, la cirugía se puede realizar en un gabinete de flujo. Encienda la almohadilla térmica y cubra la alfombra con una cortina estéril. Coloque los instrumentos estériles en la cortina estéril y coloque el R.MIW y un mínimo de dos tapas cubiertas de vidrio en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri (cierre la tapa para evitar la contaminación externa). Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando una mezcla de isoflurano/O2 al 3%. Asegúrese de que el animal esté lo suficientemente relajado como para ser fácilmente manipulado y transferido a la máscara nasal sin ninguna lucha. Transfiera el ratón de la cámara de inducción a una máscara nasal de anestesia y reduzca el nivel de isoflurano a 1.5% – 2% de mezcla de isoflurano / O2 . Verifique la anestesia completa realizando una prueba de extracción de la pata. Para realizar la prueba de extracción de la pata, pellizque firmemente la pata del animal con uñas o pinzas finales romas. En ausencia de cualquier reflejo muscular, considere al animal como inconsciente y proceda a la preparación quirúrgica. Realice esta prueba antes de la manipulación en animales y repita regularmente durante los procedimientos anestésicos y quirúrgicos para confirmar la anestesia. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la deshidratación corneal. Afeitar el área alrededor de la4ª glándula mamaria con una cuchilla de afeitar (Figura 2A). Usa el4º pezón como punto de referencia. Retire los pelos sueltos con cinta adhesiva.NOTA: Alternativamente, se puede usar crema depilatoria para eliminar los pelos. Desinfecte la piel expuesta con etanol al 80% o povidona yodada y coloque al ratón en el área quirúrgica estéril sobre su espalda con el hocico en una máscara nasal de anestesia utilizando una mezcla de isoflurano / O2 al 1,5%. Asegure las extremidades delanteras y traseras del ratón con cinta de papel.NOTA: Deje el ratón anestesiado y en recuperación en la almohadilla térmica tanto como sea posible, durante y después de la cirugía. Use una cortina o gasa quirúrgica estéril precortada para cubrir al ratón mientras deja el área quirúrgica expuesta. 3. Implantación de R.MIW (tiempo estimado: 30 min) Verifique si el animal está adecuadamente anestesiado mediante la realización de una prueba de extracción de la pata. Levante suavemente la piel con un fórceps Graefe fino y haga una incisión diagonal de 10-15 mm usando pequeñas tijeras de resorte en la piel en la parte superior de la4ª almohadilla de grasa mamaria utilizando el4º pezón como punto de orientación (Figura 2A). Asegúrese de no cortar o dañar el peritoneo o la glándula mamaria. Defina la región de interés (ROI) en función de las características macroscópicas del tejido mamario, incluida la ubicación del ganglio linfático o una lesión tumoral, y trate de mantener el ROI central con respecto a la incisión. Separe la piel de la almohadilla de grasa mamaria y las capas de tejido subyacentes mediante una disección roma de hasta 5-8 mm alrededor de la línea de incisión para crear un bolsillo que se ajuste al marco R.MIW (Figura 2BI). Recoja el R.MIW con fórceps estériles y pruebe si la incisión es lo suficientemente grande como para insertar la ventana. Si es necesario, agrande ligeramente la incisión hasta que el R.MIW encaje. Retire el R.MIW y coloque una sutura de cuerda de bolso alrededor de la incisión con una sutura de seda 5-0 (trenzada, no reabsorbible). Coloque la sutura 1-2 mm desde el borde de la incisión desde el exterior hasta el interior de la piel, comenzando desde el extremo caudal de la incisión. Mueva aproximadamente 5 mm hacia arriba a lo largo de la incisión y pase el hilo de sutura a través de la piel de adentro hacia afuera. Repita este procedimiento a lo largo del borde de la incisión, creando así una sutura circular que consta de 5-6 bucles (Figura 2BII). La salida final de la rosca de sutura debe ubicarse aproximadamente a 2-5 mm de distancia de la primera entrada.NOTA: Tenga cuidado de no colocar la sutura demasiado cerca del borde de la incisión, ya que esto aumenta el riesgo de desgarro de la piel. Colocar la sutura demasiado lejos del borde de la incisión aumenta el riesgo de infección entre el exceso de piel y el surco del R.MIW. Coloque el R.MIW dentro de la incisión y use las pinzas Graefe para colocar cuidadosamente la piel en el surco del R.MIW. Asegúrese de dejar los bucles de la sutura afuera. Tire de los bucles de la sutura de la cuerda de la bolsa y apriete la sutura en la ranura del R.MIW tirando suavemente de ambos extremos de la sutura (Figura 2BIII). Ata con nudos quirúrgicos y corta el exceso de hilo. Aplique vaselina en el borde interno del R.MIW con un palillo de dientes, mientras se asegura de evitar el tejido subyacente. Empuje suavemente el marco de la ventana hacia abajo con pinzas estériles o dos dedos, y coloque la tapa en el marco R.MIW (Figura 1B). Esto evitará un volumen de aire entre el tejido de la glándula mamaria y la tapa R.MIW. Coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios en los brazos de la tapa y apriete la tapa girando la tapa en el sentido de las agujas del reloj (aproximadamente 5 °) (Figura 1C y Figura 2BIV). Si queda algo de aire después de apretar la tapa R.MIW, use una aguja de insulina estéril para eliminar el exceso de aire. Introduzca la aguja a través de la piel en la cavidad entre el tejido mamario y el párpado y saque lentamente el émbolo, creando así un vacío entre el tejido de la glándula mamaria y el párpado R.MIW. Administrar, después de la cirugía, analgesia como buprenorfina (0,1 mg/kg diluido en NaCl estéril al 0,9%) mediante inyección subcutánea. Repetir la inyección subcutánea con buprenorfina a las 8 h y 16 h después de la cirugía. Vuelva a colocar el ratón en la jaula para recuperarse y monitorear de cerca hasta que esté completamente despierto, o continúe con el paso 4 para obtener imágenes inmediatas. En esta etapa postquirúrgica, monitoree de cerca a los ratones para detectar signos de incomodidad o complicaciones en función de parámetros vitales, como la respiración, la reactividad, el comportamiento, la postura y el peso corporal. Controle cuidadosamente la piel que rodea la ventana para detectar signos de inflamación y necrosis. Si no se producen complicaciones, el R.MIW permitirá sesiones repetidas de IVM durante varias semanas después de la implantación. Figura 2: Descripción general del procedimiento quirúrgico y la implantación de ventanas. (A) Se realiza una incisión diagonal cerca del4º pezón de un ratón hembra y la piel y el tejido subyacente se desconectan mediante disección roma. (B) El ganglio linfático inguinal y la forma de la almohadilla de grasa se pueden usar para la orientación correcta del tejido (I). Se coloca una sutura de cuerda de bolso en la piel alrededor de la incisión (II), y después de encajar en el marco de la ventana, la sutura se aprieta en la ranura para asegurar el marco de la ventana y se asegura mediante nudos quirúrgicos (III). El último paso es la inserción y el bloqueo de la tapa en el marco de la ventana (IV). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Microscopía intravital repetida a través del R.MIW NOTA: La estrategia de IVM repetida descrita aquí se optimizó para un sistema confocal multifotón invertido equipado con una etapa motorizada y una cámara de clima oscuro a 35.8 ° C. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando una mezcla de isoflurano/O2 al 3%. Verifique la pérdida de conciencia realizando una prueba de extracción de la pata (descrita en el paso 2.6). Aplique ungüento para los ojos para prevenir la deshidratación corneal durante la sesión de imágenes. Inspeccione el estado del marco y la tapa R.MIW, incluida la estabilidad de las suturas o cualquier daño potencial a la tapa. En caso de daño a la tapa, la tapa se puede reemplazar como se describe en el paso 5. Transfiera el ratón a una caja de imágenes precalentada (37 °C) hecha a medida (Figura 3A) y coloque el ratón con la cabeza en el cono de la nariz. La caja de imágenes consiste en un marco que encaja dentro de la etapa automatizada del microscopio. El marco está diseñado para sostener una incrustación hecha a medida con un orificio del diámetro del R.MIW (Figura 3A). Una entrada con un cono de nariz se conecta a la parte frontal de la caja y se conecta a una estación de vaporizador de isoflurano utilizando una mezcla de isoflurano / O2 al 2% al 2%. Una toma de corriente está conectada a una unidad de eliminación anestésica para garantizar la circulación y evitar la acumulación de isoflurano en la caja. La caja de imágenes se puede cerrar con una tapa transparente. Coloque el ratón sobre la incrustación de tal manera que el R.MIW caiga en el orificio de la incrustación de la caja de imágenes (Figura 3A). Aplique parafilm y cinta de papel sobre la parte posterior del ratón para estabilizar el ratón y reducir el movimiento del tejido debido a la respiración. Cierre la caja de imágenes con la tapa e inserte la caja de imágenes en la etapa del microscopio. Reduzca la dosis de isoflurano gradualmente en el transcurso de la sesión de imágenes para mantener una anestesia estable pero superficial (típicamente entre 1.5% -0.8% de mezcla de isoflurano / O2 ). Proporcione una nutrición adecuada durante las imágenes como se describe a continuación. Para sesiones de imagen <3 h, inyecte al ratón por vía subcutánea 200-300 μL de PBS estéril para la hidratación. Para sesiones de imágenes >3 h, siga los pasos que se detallan a continuación. Para obtener imágenes a largo plazo, infunda nutrientes al ratón. Para esto, use una mezcla de infusión estéril disponible comercialmente que contenga aminoácidos y glucosa. Coloque una aguja flexible por vía subcutánea en el cuello del ratón y asegúrela con cinta de papel. Conecte una jeringa de 10 ml con la mezcla de nutrientes preparada a un tubo de silicio flexible y empuje la mezcla de nutrientes hasta que haya llegado al final del tubo. Conecte el tubo de silicona a la aguja flexible. Tome el extremo del tubo y colóquelo a través de uno de los orificios de la caja de imágenes (de adentro hacia afuera, dejando el lado del accesorio de la aguja en la caja). Inyecte 50 μL de solución de infusión cada 30 min. Asegure la caja de imágenes en la etapa del microscopio y defina el área de interés utilizando el modo de epifluorescencia del microscopio. Aplique la configuración deseada del microscopio según el modelo de ratón (Figura 3B). Las estructuras de los vasos, los patrones de colágeno (visualizados por la segunda generación armónica) y otras estructuras anatómicas estables, incluido el ganglio linfático inguinal, se pueden usar como puntos de referencia. Adquiera imágenes utilizando un microscopio confocal multifotón invertido a una profundidad de 12 bits y un objetivo de agua 25x utilizando un tamaño de paso Z que varía de 1.0 a 4.0 μm (pila z total que varía de 150 a 800 μm). Aplique la siguiente configuración estándar: formato de 1024 x 1024, velocidad de escaneo de 600 Hz, modo bidireccional. Visualice las fibras de colágeno I realizando una segunda generación armónica utilizando una longitud de onda de excitación de 860 nm y detección a 425-435 nm. Las longitudes de onda de excitación y detección para los diferentes fluoróforos se indican en la Tabla 1. Tabla 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Utilice la función Espiral en el modo de navegador de software de imágenes para generar una gran visión general de tilescan para crear un mapa de referencia del tejido (Figura 3B). Defina los ROI dentro de la visión general en espiral, defina los planos Z superior e inferior para determinar la pila Z. Pulse Inicio para obtener pilas Z tridimensionales (xyz) o cuatridimensionales detalladas (xyzt) del tejido.NOTA: Durante todo el experimento de imagen, el ratón debe ser monitoreado de cerca. Para sesiones de imágenes largas, se recomienda un oxímetro de pulso y una sonda de temperatura. La respiración del ratón debe ser regular y al mismo ritmo. Si el ratón comienza a mostrar signos de jadeo, se debe reducir la cantidad de isoflurano. Al final de cada sesión de imágenes, mantenga el ratón en una almohadilla térmica hasta que esté completamente despierto. Si el ratón muestra signos de incomodidad o movilidad reducida, mantenga la jaula durante más tiempo en la almohadilla térmica y proporcione geles nutritivos en lugar del chow regular.NOTA: Entre las sesiones de imágenes, el ratón debe ser monitoreado de cerca para detectar signos de incomodidad, como disminución del consumo de alimentos y agua, respiración rápida, disminución del movimiento, temblor, postura corporal anormal o pelaje descuidado. En caso de signos claros de incomodidad, siga las pautas institucionales con respecto al bienestar animal y finalice el experimento cuando se alcance el punto final humanitario. Repita los pasos 4.1 a 4.12 para cada sesión de imagen repetida y utilice el mosaico de información general para volver sobre las mismas posiciones en varios puntos de tiempo (Figura 3B). La frecuencia de las imágenes dependerá de la pregunta de investigación y el momento del proceso estudiado, y generalmente varía de sesiones de imágenes dos veces al día a una vez por semana. Al final del período experimental deseado, sacrificar a los animales con un R.MIW implantado utilizando anestesia profunda con isoflurano seguido de dislocación cervical. Si lo desea, diseccione los órganos de interés para realizar más análisis ex vivo . Alternativamente, mantenga al animal vivo para futuros análisis in vivo . En ese caso, retire la sutura de la bolsa que sujeta el R.MIW cortándola con tijeras de resorte y separe cuidadosamente el anillo de la ventana de la piel del ratón con pinzas romas. Limpie los bordes de la piel que anteriormente sostenían la ventana y proceda con una sutura continua simple (material absorbible, como el ácido poliglicólico). Una vez cerrada la piel, ata los hilos de sutura inicial y final con dos nudos cuadrados (4 lanzamientos). Para minimizar la isquemia tisular, los nudos deben estar lo suficientemente sueltos como para permitir el flujo sanguíneo en el borde de la piel. Desinfecte la herida con povidona yodada para prevenir la inflamación y promover la curación de la piel. Figura 3: Flujo de trabajo de IVM longitudinal. (A) Representación esquemática de un experimento típico de IVM de varios días. (B) Imágenes de una región tumorígena dentro de la glándula mamaria adulta. Antes de cada sesión de imágenes, un mosaico de visión general de baja resolución (panel superior) puede facilitar la identificación de la(s) región(es) de interés en los días de imagen posteriores. El patrón de colágeno I (segunda generación armónica, magenta), la estructura del tejido y los patrones de células marcadas diferencialmente con proteínas fluorescentes (representadas en verde, amarillo y rojo) se pueden usar para volver sobre la misma área de tejido. Las barras de escala representan 1 mm (vista general tilescan) y 100 μm (paneles inferiores). (C) Representación esquemática del constructo reportero R26-Confetti . Tras la recombinación de Cre inducida por tamoxifeno, el constructo de Confetti se recombina estocásticamente, lo que resulta en la expresión de uno de los cuatro fluoróforos (nGFP, YFP, RFP o mCFP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. Abrir y cerrar la tapa del R.MIW entre sesiones de imagen Mantenga la esterilidad mediante el uso de guantes estériles y esterilice todos los artículos que entren en contacto con el ratón. Herramientas quirúrgicas de autoclave antes de la cirugía (consulte el paso 2 para obtener más detalles). Encienda la almohadilla térmica y cubra la alfombra con una cortina estéril y anestesia el ratón en una cámara de inducción utilizando una mezcla de isoflurano/O2 al 3%. Verifique la anestesia adecuada realizando una prueba de reflejo de extracción de la pata. Transfiera el ratón de la cámara de inducción a una máscara nasal de anestesia y reduzca el nivel de isoflurano a 1.5% -2% de mezcla de isoflurano / O2 . Coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios en los brazos de la tapa y afloje la tapa girando la tapa en sentido contrario a las agujas del reloj. Si es necesario, aplique un poco de PBS estéril precalentado (37 °C) en la ventana para facilitar el aflojamiento de la tapa. Coloque la tapa del R.MIW en un plato estéril con PBS estéril hasta su uso posterior. Limpie el vidrio de la tapa con demi-agua y posteriormente etanol al 80%. Mantenga la tapa en PBS estéril hasta su uso posterior. Evite que el tejido expuesto se seque agregando algunas gotas de PBS estéril a la superficie del tejido. Aplicar o inyectar cualquier sustancia o células de interés sobre el tejido expuesto, se puede utilizar un volumen máximo de 50 μL. Espere unos minutos hasta que el líquido sea absorbido por el tejido. Alternativamente, el tejido se puede manipular o reposicionar utilizando fórceps estériles y contundentes para optimizar las condiciones de imagen para ROI específicos. Aplique vaselina en el borde interno del R.MIW, asegurándose de evitar el tejido subyacente. Coloque la tapa en el marco R.MIW como se describe en el paso 3.9, coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios en los brazos de la tapa y apriete la tapa girando la tapa en el sentido de las agujas del reloj (aproximadamente 5 °).