Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

Larissa Mourao; Marta Ciwinska; Jacco van Rheenen; Colinda L. G. J. Scheele

doi:10.3791/63326

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Biology

Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

Published: January 20, 2022

doi:

10.3791/63326

Larissa Mourao^1,2, Marta Ciwinska^1,2, Jacco van Rheenen³, Colinda L. G. J. Scheele^1,2

¹Center for Cancer Biology,VIB (BE), ²Department of Oncology,KU Leuven (BE), ³Netherlands Cancer Institute, Department of Molecular Pathology,Oncode Institute (NL)

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges Brustbildfenster mit einem austauschbaren Deckel (R.MIW). Die intravitale Mikroskopie nach Implantation des R.MIW ermöglicht eine Längs- und Mehrtagesbildgebung der gesunden und erkrankten Brustdrüse mit zellulärer Auflösung während der verschiedenen Entwicklungsstadien.

Abstract

Die verzweigte Struktur der Brustdrüse ist hochdynamisch und durchläuft nach der Geburt mehrere Phasen des Wachstums und der Umgestaltung. Die intravitale Mikroskopie in Kombination mit einer Hautlappenoperation oder der Implantation von Bildgebungsfenstern wurde verwendet, um die Dynamik der gesunden Brustdrüse in verschiedenen Entwicklungsstadien zu untersuchen. Die meisten Brustbildgebungstechnologien sind auf einen Zeitrahmen von Stunden bis Tagen beschränkt, während die Mehrheit der Brustdrüsen-Umbauprozesse in Zeitrahmen von Tagen bis Wochen stattfindet. Um den Umbau der Brustdrüse zu untersuchen, sind Methoden erforderlich, die einen optischen Zugang zu dem interessierenden Gewebe für längere Zeiträume ermöglichen. Hier wird eine verbesserte Version des Titan-Brustbildgebungsfensters mit einem austauschbaren Deckel (R.MIW) beschrieben, die eine hochauflösende Bildgebung der Brustdrüse mit einer zellulären Auflösung für bis zu mehreren Wochen ermöglicht. Wichtig ist, dass das R.MIW über die gesamte Dauer des intravitalen Bildgebungsexperiments Zugang zu Gewebe bietet und daher für die lokale Gewebemanipulation, Markierung, Arzneimittelverabreichung oder bildgeführte Mikrodissektion verwendet werden könnte. Zusammengenommen ermöglicht das R.MIW eine hochauflösende Charakterisierung der Zelldynamik während der Brustdrüsenentwicklung, Homöostase und Erkrankung.

Introduction

Das Brustepithel ist ein einzigartiges sekretorisches Organ bei Säugetieren, das Milch produziert und absondert, um Nachkommen zu ernähren. Im Laufe des Lebens durchläuft die Brustdrüse mehrere Entwicklungs- und Wachstumsrunden, die von strukturellen und funktionellen Veränderungen des Gewebes begleitet^{werden 1}. Abhängig vom Entwicklungsstadium sind die Zelltypen, die zum Gewebeumbau beitragen, unterschiedlich, ebenso wie die Position innerhalb des duktalen Baumes.

Die intravitale Multiphotonenmikroskopie (IVM) ermöglicht die Untersuchung der Brustzelldynamik in vivo in der nativen und minimal gestörten Einstellung ^2,3,4. Um einen visuellen Zugang zur Brustdrüse zu erhalten, wurden mehrere temporäre Ex-vivo– oder Hautlappenbildgebungstechniken in verschiedenen Stadien der Brustdrüsenentwicklung veröffentlicht, darunter Pubertät 4,5,6,7, Erwachsenenalter ^2,8, Laktation ^9,10,11,12 und Tumordynamik ^13,14^,¹⁵. Obwohl diese Techniken zu einer hohen räumlich und zeitlich aufgelösten Bildgebung der Brustzelldynamik führen, ist der Zeitrahmen auf Stunden begrenzt, während die meisten Brustdrüsen-Umbauprozesse Tage bis Wochen dauern. Daher sind Methoden erforderlich, die einen optischen Zugang zu dem interessierenden Gewebe für längere Zeiträume ermöglichen. Im Laufe der Jahre wurden mehrere permanente Bildgebungsfenster für die Bildgebung von Brusttumoren 15,16,17,18 entwickelt, darunter ein Titan-Brustbildgebungsfenster (MIW) 2,3,19. Obwohl es sehr nützlich war, das Wachstum von Brusttumoren zu untersuchen, blieb die Visualisierung der gesunden Brustdrüsenstruktur auf einige Tage beschränkt. Vor kurzem wurde ein flexibles Silizium-Bildgebungsfenster entwickelt, das die Visualisierung der pubertären Brustdrüse über mehrere Wochen^{ermöglicht 20}. Die Brustdrüse ist jedoch in ein adipozytenreiches Fettpolster eingebettet, was zu einer ausgedehnten Lichtstreuung und damit zu einer eingeschränkten Sichtbarkeit der brustduktalen Strukturen führt. Daher sind jederzeit überlegene Bildgebungsbedingungen erforderlich, um die Gewebedynamik über längere Zeiträume in der Brustdrüse sichtbar zu machen. Weder das klassische MIW noch das flexible Siliziumfenster erlauben eine Gewebemanipulation oder Optimierung der physikalischen Gewebelokalisation vor der Bildgebung, da das Fenster nach der Operation und Implantation ein geschlossenes System bildet. Infolgedessen wird ein optimaler optischer Zugang zum darunter liegenden Brustgewebe wahrscheinlich über längere Zeiträume ausgeschlossen. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Hautlappentechnik die Optimierung und Neupositionierung des Gewebes während der Bildgebungssitzung und ein Hautlappen kann mehrmals^{wiederholt werden 2}. Wiederholte bildgebende Sitzungen durch einen Hautlappen sind jedoch nur möglich, wenn zwischen den Operationen ausreichend Zeit (mindestens 7 Tage) eingeplant wird, um eine Erholung der Haut zu ermöglichen, und eignen sich daher meist für die Untersuchung von Prozessen auf längeren Zeitskalen. Darüber hinaus ist es ratsam, dieses Verfahren aufgrund seiner invasiven Natur und des großen Risikos von Infektionen und Narbenbildung beim Wundverschluss nicht viele Male durchzuführen.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, d.h. optimale Bildgebungsbedingungen über einen längeren Zeitraum mit hoher Frequenz zu gewährleisten und gleichzeitig eine Gewebemanipulation zu ermöglichen, wurde eine verbesserte Titanversion des MIW mit einem austauschbaren Deckel (R.MIW) entwickelt, um die gesunde und kranke Brustdrüse über mehrere Tage bis Wochen zu visualisieren² (Abbildung 1A, B). Der R.MIW wurde speziell entwickelt, um einen optimalen Gewebezugang zu ermöglichen, eine direkte Gewebemanipulation über die gesamte Dauer des IVM-Experiments zu ermöglichen und dadurch die Visualisierung der Brustdrüse zur richtigen Zeit und am richtigen Ort über längere Zeiträume zu ermöglichen. Im geschlossenen Zustand bildet der R.MIW ein luftdichtes System, das mit dem klassischen MIW vergleichbar ist (Abbildung 1C). Wenn das R.MIW unter aseptischen Bedingungen geöffnet wird, ermöglicht es die lokale Gewebemanipulation, um den optischen Zugang zu verbessern, und ermöglicht auch die lokale Verabreichung von Substanzen wie Signalweghemmern oder Agonisten, die Injektion verschiedener Zelltypen von Interesse, wie Krebszell- oder Immunzellpopulationen, oder die Zugabe von Gewebemarkierungsfarbstoffen. Der Deckel kann jederzeit zwischen den Bildgebungssitzungen geöffnet werden, ohne das darunter liegende Gewebe zu beschädigen.

Abbildung 1: Gestaltung des Brustbildfensters mit austauschbarem Deckel. (A) Draufsicht und Seitenansicht des austauschbaren Deckels des Brustbildfensters mit einem 10 mm Deckglas, das auf den Ring geklebt ist. (B) Draufsicht und Seitenansicht des Brustbildfensters, das aus einem äußeren Ring und einem inneren Ring mit einer Nut dazwischen besteht, um das Fenster innerhalb der Haut der Maus mit einer Handtuchnaht zu sichern. Der äußere Ring hat eine kleine Rille, die zu den vier Vorsprüngen (Armen) des Deckels passt. (C) Karikaturen und Bilder, die die Öffnungs- und Schließmechanismen des Deckels demonstrieren. Die schrägen Vorsprünge sorgen dafür, dass der Deckel im Fensterrahmen befestigt ist. Diese Figur wurde von Messal et al. ² modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Dieses Protokoll beschreibt das Design- und Implantationsverfahren des R.MIW sowie eine longitudinale IVM-Strategie, um die gleichen Brustgänge und ihre Visualisierung mit zellulärer Auflösung erneut zu betrachten. Das R.MIW ermöglicht es, Zellteilungen und morphologische Veränderungen während verschiedener Entwicklungsphasen der Brustdrüse in verschiedenen fluoreszierenden Reporter-Mausmodellen zu verfolgen. Zusammengenommen ermöglicht das R.MIW eine hochauflösende Charakterisierung der Zelldynamik während der Entwicklung der Brustdrüse, der Homöostase und der Erkrankung.

Protocol

Alle in diesem Papier beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der IACUC und der KU Leuven durchgeführt und im Rahmen des genehmigten Projektantrags P160/2020 durchgeführt. Bevor Sie dieses Protokoll ausführen, überprüfen Sie bitte die Analgesiestrategie mit dem institutionellen Tierarzt und verabreichen Sie die prä- und postoperative Analgesie gemäß den institutionellen Richtlinien. 1. Vorbereitung des R.MIW (voraussichtlicher Zeitpunkt: 2 h) HINWEIS: Für den Bau des R.MIW ist es ratsam, einen lokalen Hersteller zu finden, der sich auf die Arbeit mit harten Materialien wie Titan spezialisiert hat, da dies spezielle Werkzeuge und Fachwissen erfordert. Werkstätten, die sich auf die Entwicklung und Herstellung von Titanprothesen spezialisiert haben, verfügen in der Regel über die Maschinen und das Know-how, um die R.MIW-Teile herzustellen. Legen Sie den Deckel des R.MIW auf eine sterile Oberfläche, wobei die Außenseite des Deckels nach oben zeigt (und die Arme des Deckels nach unten geneigt sind; Abbildung 1A). Tragen Sie Cyanacrylat-Kleber um den gesamten Rand des Deckels auf und legen Sie vorsichtig einen 10 mm runden Glasabzug auf den Deckel.HINWEIS: Bereiten Sie während des chirurgischen Eingriffs immer einen Ersatzdeckel mit einem Glasdeckglas als Backup vor. Verwenden Sie einen sterilen Holzstäbchen, um das Glasdeckglas zu positionieren, und drücken Sie es mit etwas Kraft nach unten, um eine luftdichte Abdichtung zwischen dem Glasdeckglas und dem Rahmen des Deckels zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Löcher in den Armen des Deckels nicht vom Glas verdeckt werden. Desinfizieren Sie die Deckel und den R.MIW, indem Sie mindestens 30 Minuten lang in 80% Ethanol in eine geschlossene Petrischale tauchen.HINWEIS: Lassen Sie die Deckel nicht länger als 1 h in 80% Ethanol liegen, um die Auflösung des Cyanacrylat-Klebstoffs zu vermeiden. Entfernen Sie den überschüssigen Cyanacrylatkleber vom Glasdeckglas, indem Sie eine in Aceton getränkte Baumwollspitze verwenden. Lagern Sie die Deckel und den R.MIW bis zur weiteren Verwendung in einer sterilen Umgebung.HINWEIS: Der R.MIW-Rahmen und die Deckel können maximal 1 Woche lang in einem sterilen Schlauch oder Beutel aufbewahrt werden. Prüfen Sie bei der Wiederaufnahme des Experiments immer, ob der Glasdeckzettel noch ordnungsgemäß am Deckel befestigt ist, bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren. 2. Vorbereitung auf die Operation (voraussichtlicher Zeitpunkt: 15 min) HINWEIS: Für das R.MIW-Implantationsverfahren können weibliche Mäuse (>3,5 Wochen alt) eines beliebigen Stammes verwendet werden. Bewahren Sie die Sterilität, indem Sie sterile Handschuhe verwenden, und sterilisieren Sie alle Gegenstände, die mit der Maus in Berührung kommen. Chirurgische Werkzeuge mit Wasser und milder Seife waschen, an der Luft trocknen, in Aluminiumfolie ohne freiliegende Ecken oder Kanten wickeln und mit einem Autoklaven für einen Zyklus von 20 Minuten bei 120 ° C vor der Operation sterilisieren. Bereiten Sie eine sterile chirurgische Plattform vor und sterilisieren Sie die Oberflächen mit 80% Ethanol.HINWEIS: Um die Sterilität zu gewährleisten, kann die Operation in einem Durchflussschrank durchgeführt werden. Schalten Sie das Heizkissen ein und bedecken Sie die Matte mit einem sterilen Vorhang. Ordnen Sie die sterilen Instrumente auf dem sterilen Vorhang an und legen Sie die R.MIW und mindestens zwei glasbedeckte Deckel in sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine Petrischale (schließen Sie den Deckel, um eine externe Kontamination zu vermeiden). Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit einem 3% Isofluran / O2-Gemisch. Stellen Sie sicher, dass das Tier entspannt genug ist, um leicht manipuliert und ohne Probleme auf die Nasenmaske übertragen zu werden. Übertragen Sie die Maus aus der Induktionskammer in eine Anästhesie-Nasenmaske und reduzieren Sie den Isofluran-Gehalt auf 1,5% – 2% Isofluran/O2-Mischung. Überprüfen Sie die Vollnarkose, indem Sie einen Pfotenentzugstest durchführen. Um den Pfotenentzugstest durchzuführen, kneifen Sie die Tierpfote mit Fingernägeln oder stumpfen Endzangen fest zusammen. In Ermangelung eines Muskelreflexes betrachten Sie das Tier als bewusstlos und fahren Sie mit der chirurgischen Vorbereitung fort. Führen Sie diesen Test vor der Tiermanipulation durch und wiederholen Sie ihn regelmäßig während der Anästhesie- und chirurgischen Eingriffe, um die Anästhesie zu bestätigen. Tragen Sie Augensalbe auf, um Hornhautaustrocknung zu verhindern. Rasieren Sie den Bereich um die4. Brustdrüse mit einer Rasierklinge (Abbildung 2A). Nutzen Sie die 4.Brustwarze als Wahrzeichen. Entfernen Sie lose Haare mit Klebeband.HINWEIS: Alternativ kann Enthaarungscreme verwendet werden, um die Haare zu entfernen. Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 80% Ethanol oder Povidon-Jod und positionieren Sie die Maus im sterilen Operationsbereich auf dem Rücken mit der Schnauze in eine Anästhesie-Nasenmaske mit 1,5% Isofluran/O2-Gemisch. Befestigen Sie die Vorder- und Hinterbeine der Maus mit Papierband.HINWEIS: Lassen Sie die betäubte und sich erholende Maus während und nach der Operation so weit wie möglich auf dem Heizkissen. Verwenden Sie ein vorgeschnittenes steriles chirurgisches Tuch oder eine Gaze, um die Maus abzudecken, während Sie den Operationsbereich freilegen. 3. R.MIW-Implantation (geschätzter Zeitpunkt: 30 min) Überprüfen Sie, ob das Tier ausreichend betäubt ist, indem Sie einen Pfotenentzugstest durchführen. Heben Sie die Haut sanft mit einer feinen Graefe-Pinzette an und machen Sie einen diagonalen Schnitt von 10-15 mm mit einer kleinen Federschere in der Haut auf dem 4. Brustfettpolster mit der 4.Brustwarze als Orientierungspunkt (Abbildung 2A). Achten Sie darauf, das Peritoneum oder die Brustdrüse nicht zu schneiden oder zu beschädigen. Definieren Sie die Region of Interest (ROI) basierend auf makroskopischen Merkmalen des Brustgewebes, einschließlich der Lage des Lymphknotens oder einer Tumorläsion, und versuchen Sie, den ROI in Bezug auf den Schnitt zentral zu halten. Trennen Sie die Haut vom Brustfettpad und den darunter liegenden Gewebeschichten mit stumpfer Dissektion von bis zu 5-8 mm rund um die Inzisionslinie, um eine Tasche für den R.MIW-Rahmen zu schaffen (Abbildung 2BI). Nehmen Sie die R.MIW mit einer sterilen Pinzette auf und testen Sie, ob der Schnitt groß genug ist, um das Fenster einzusetzen. Falls erforderlich, vergrößern Sie den Schnitt leicht, bis der R.MIW hineinpasst. Entfernen Sie den R.MIW und legen Sie eine Handtuch-String-Naht rund um den Einschnitt mit einer 5-0-Seidennaht (geflochten, nicht resorbierbar). Platzieren Sie die Naht 1-2 mm vom Rand des Einschnitts von außen bis zur Innenseite der Haut, beginnend mit dem kaudalen Ende des Einschnitts. Bewegen Sie sich ca. 5 mm entlang des Einschnitts nach oben und führen Sie den Nahtfaden von innen nach außen durch die Haut. Wiederholen Sie diesen Vorgang entlang der Kante des Einschnitts, wodurch eine kreisförmige Naht aus 5-6 Schleifen erzeugt wird (Abbildung 2BII). Der endgültige Ausgang des Nahtgewindes sollte sich ca. 2-5 mm vom ersten Eingang entfernt befinden.HINWEIS: Achten Sie darauf, die Naht nicht zu nahe am Rand des Schnitts zu platzieren, da dies das Risiko eines Hautrisses erhöht. Wenn die Naht zu weit vom Rand des Einschnitts entfernt platziert wird, erhöht sich das Infektionsrisiko zwischen der überschüssigen Haut und der Rille des R.MIW. Bringen Sie die R.MIW in den Schnitt und verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die Haut vorsichtig in die Rille des R.MIW zu legen. Achten Sie darauf, die Schlaufen der Naht draußen zu lassen. Ziehen Sie an den Schlaufen der Handtuch-Saitennaht und ziehen Sie die Naht in der Nut des R.MIW fest, indem Sie vorsichtig an beiden Enden der Naht ziehen (Abbildung 2BIII). Mit chirurgischen Knoten abbinden und den überschüssigen Faden abschneiden. Tragen Sie Vaseline mit einem Zahnstocher auf den inneren Rand des R.MIW auf, während Sie darauf achten, das darunter liegende Gewebe zu vermeiden. Drücken Sie den Fensterrahmen vorsichtig mit einer sterilen Pinzette oder zwei Fingerspitzen nach unten und positionieren Sie den Deckel im R.MIW-Rahmen (Abbildung 1B). Dadurch wird ein Luftvolumen zwischen dem Brustdrüsengewebe und dem R.MIW-Deckel vermieden. Legen Sie die Spitzen der dünnen Pinzette durch die Löcher in den Armen des Deckels und ziehen Sie den Deckel fest, indem Sie den Deckel im Uhrzeigersinn drehen (ca. 5 °) (Abbildung 1C und Abbildung 2BIV). Wenn nach dem Anziehen des R.MIW-Deckels etwas Luft übrig bleibt, verwenden Sie eine sterile Insulinnadel, um die überschüssige Luft zu entfernen. Führen Sie die Nadel durch die Haut in den Hohlraum zwischen dem Brustgewebe und dem Deckel ein und ziehen Sie langsam den Kolben heraus, wodurch ein Vakuum zwischen dem Brustdrüsengewebe und dem R.MIW-Deckel entsteht. Verabreichen, nach der Operation, Analgesie wie Buprenorphin (0,1 mg/kg verdünnt in sterilen 0,9% NaCl) durch subkutane Injektion. Wiederholen Sie die subkutane Injektion mit Buprenorphin um 8 h und 16 h nach der Operation. Setzen Sie die Maus zurück in den Käfig, um sich zu erholen und genau zu überwachen, bis sie vollständig wach ist, oder fahren Sie mit Schritt 4 fort, um eine sofortige Bildgebung zu ermöglichen. Überwachen Sie die Mäuse in diesem postoperativen Stadium genau auf Anzeichen von Beschwerden oder Komplikationen, basierend auf Vitalparametern wie Atmung, Reaktivität, Verhalten, Haltung und Körpergewicht. Überwachen Sie die Haut, die das Fenster umgibt, sorgfältig auf Anzeichen von Entzündungen und Nekrose. Wenn keine Komplikationen auftreten, ermöglicht das R.MIW wiederholte IVM-Sitzungen über mehrere Wochen nach der Implantation. Abbildung 2: Überblick über den chirurgischen Eingriff und die Fensterimplantation . (A) Ein diagonaler Schnitt wird in der Nähe der 4. Brustwarze einer weiblichen Maus gemacht und die Haut und das darunter liegende Gewebe werden durch stumpfe Dissektion getrennt. (B) Der Leistenlymphknoten und die Form des Fettpolsters können zur richtigen Orientierung des Gewebes verwendet werden (I). Eine Handtasche-String-Naht wird in die Haut um den Schnitt (II) gelegt, und nach dem Einsetzen in den Fensterrahmen wird die Naht in der Nut festgezogen, um den Fensterrahmen zu sichern, und durch chirurgische Knoten (III) gesichert. Der letzte Schritt ist das Einsetzen und Verriegeln des Deckels in den Fensterrahmen (IV). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 4. Wiederholte intravitale Mikroskopie durch das R.MIW HINWEIS: Die hier beschriebene wiederholte IVM-Strategie wurde für ein invertiertes multiphotonenkonfokales System optimiert, das mit einem motorisierten Tisch und einer dunklen Klimakammer bei 35,8 °C ausgestattet ist. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit einem 3% Isofluran / O2-Gemisch. Überprüfen Sie den Bewusstlosigkeitsverlust, indem Sie einen Pfotenentzugstest durchführen (beschrieben in Schritt 2.6). Tragen Sie Augensalbe auf, um Hornhautaustrocknung während der Bildgebungssitzung zu verhindern. Überprüfen Sie den Zustand des R.MIW-Rahmens und des Deckels, einschließlich der Stabilität der Nähte oder möglicher Schäden am Deckel. Im Falle einer Beschädigung des Deckels kann der Deckel wie in Schritt 5 beschrieben ausgetauscht werden. Bringen Sie die Maus in eine vorgewärmte (37 °C), maßgeschneiderte Bildgebungsbox (Abbildung 3A) und legen Sie die Maus mit dem Kopf in den Nasenkonus. Die Imaging-Box besteht aus einem Rahmen, der in die automatisierte Stufe des Mikroskops passt. Der Rahmen ist so konzipiert, dass er ein maßgeschneidertes Inlay mit einem Loch im Durchmesser des R.MIW aufnehmen kann (Abbildung 3A). Ein Einlass mit einem Nasenkonus ist mit der Vorderseite der Box verbunden und mit einer Isofluran-Verdampferstation unter Verwendung von 2% -3% Isofluran /O2-Mischung befestigt. Ein Auslass ist mit einer Anästhesie-Aasfresseinheit verbunden, um die Zirkulation zu gewährleisten und die Ansammlung von Isofluran in der Box zu verhindern. Die Imaging-Box kann mit einem transparenten Deckel verschlossen werden. Positionieren Sie die Maus auf dem Inlay so, dass der R.MIW in das Loch des Imaging Box Inlays fällt (Abbildung 3A). Tragen Sie Parafilm und Papierklebeband auf den Rücken der Maus auf, um die Maus zu stabilisieren und die Gewebebewegung aufgrund der Atmung zu reduzieren. Schließen Sie die Bildgebungsbox mit dem Deckel und setzen Sie die Bildgebungsbox in die Stufe des Mikroskops ein. Reduzieren Sie die Isofluran-Dosis im Laufe der Bildgebungssitzung schrittweise, um eine stabile, aber oberflächliche Anästhesie aufrechtzuerhalten (typischerweise zwischen 1,5% -0,8% Isofluran /O2-Mischung). Sorgen Sie während der Bildgebung für die richtige Ernährung, wie unten beschrieben. Für bildgebende Sitzungen <3 h injizieren Sie der Maus subkutan 200-300 μL steriles PBS zur Hydratation. Führen Sie für Bildgebungssitzungen >3 h die unten beschriebenen Schritte aus. Für die Langzeitbildgebung infundieren Sie die Maus mit Nährstoffen. Verwenden Sie dazu eine handelsübliche sterile Infusionsmischung, die Aminosäuren und Glukose enthält. Legen Sie eine flexible Nadel subkutan in den Hals der Maus und befestigen Sie sie mit Papierband. Befestigen Sie eine 10 ml Spritze mit der vorbereiteten Nährstoffmischung an einem flexiblen Siliziumröhrchen und drücken Sie die Nährstoffmischung durch, bis sie das Ende des Röhrchens erreicht hat. Verbinden Sie den Silikonschlauch mit der flexiblen Nadel. Nehmen Sie das Ende des Schlauches und legen Sie es durch eines der Löcher der Bildgebungsbox (von innen nach außen, wobei die Nadelbefestigungsseite in der Box verbleibt). Injizieren Sie alle 30 Minuten 50 μL Infusionslösung. Befestigen Sie die Bildgebungsbox in der Stufe des Mikroskops und definieren Sie den Interessenbereich mit dem Epifluoreszenzmodus des Mikroskops. Wenden Sie je nach Mausmodell die gewünschten Mikroskopeinstellungen an (Abbildung 3B). Gefäßstrukturen, Kollagenmuster (visualisiert durch zweite harmonische Generation) und andere stabile anatomische Strukturen, einschließlich des Leistenlymphknotens, können als Landmarken verwendet werden. Erfassen Sie Bilder mit einem inversen Multiphotonen-Konfokalmikroskop in einer Tiefe von 12 Bit und einem 25-fachen Wasserobjektiv mit einer Z-Schritt-Größe von 1,0 bis 4,0 μm (Gesamt-Z-Stack von 150 bis 800 μm). Wenden Sie die folgenden Standardeinstellungen an: Format 1024 x 1024, Scangeschwindigkeit von 600 Hz, bidirektionaler Modus. Visualisieren Sie Kollagen-I-Fasern, indem Sie eine zweite harmonische Generierung durchführen, indem Sie eine Anregungswellenlänge von 860 nm und eine Detektion bei 425-435 nm verwenden. Anregungs- und Detektionswellenlängen für die verschiedenen Fluorophore sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Verwenden Sie die Spiralfunktion im Navigatormodus der Bildgebungssoftware, um einen großen Übersichtskacheln zu generieren, um eine Referenzkarte des Gewebes zu erstellen (Abbildung 3B). Definieren Sie die ROIs innerhalb der Spiralübersicht, definieren Sie die obere und untere Z-Ebene, um den Z-Stack zu bestimmen. Drücken Sie Start , um detaillierte dreidimensionale (xyz) oder vierdimensionale Z-Stacks (xyzt) des Gewebes zu erhalten.HINWEIS: Während des gesamten bildgebenden Experiments sollte die Maus genau überwacht werden. Für lange Bildgebungssitzungen werden ein Pulsoximeter und ein Temperaturfühler empfohlen. Die Atmung der Maus sollte regelmäßig und im gleichen Tempo sein. Wenn die Maus Anzeichen von Keuchen zeigt, sollte die Menge an Isofluran reduziert werden. Halten Sie am Ende jeder Bildgebungssitzung die Maus auf einem Heizkissen, bis sie vollständig wach ist. Wenn die Maus Anzeichen von Unbehagen oder eingeschränkter Mobilität zeigt, halten Sie den Käfig länger auf dem Heizkissen und stellen Sie Nährstoffgele anstelle des normalen Chow zur Verfügung.HINWEIS: Zwischen den bildgebenden Sitzungen sollte die Maus engmaschig auf Anzeichen von Beschwerden wie verminderten Nahrungs- und Wasserverbrauch, schnelle Atmung, verminderte Bewegung, Zittern, abnormale Körperhaltung oder ungepflegtes Fell überwacht werden. Befolgen Sie bei deutlichen Anzeichen von Unbehagen die institutionellen Richtlinien zum Tierschutz und beenden Sie das Experiment, wenn der humane Endpunkt erreicht ist. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.12 für jede wiederholte Bildverarbeitungssitzung, und verwenden Sie die Übersichtskachel, um dieselbe Position(en) über mehrere Zeitpunkte zurückzuverfolgen (Abbildung 3B). Die Häufigkeit der Bildgebung hängt von der Forschungsfrage und dem Zeitpunkt des untersuchten Prozesses ab und variiert typischerweise von Bildgebungssitzungen zweimal täglich bis einmal pro Woche. Am Ende des gewünschten Versuchszeitraums euthanasieren Sie die Tiere mit einem implantierten R.MIW in tiefer Anästhesie mit Isofluran, gefolgt von einer Zervixdislokation. Falls gewünscht, sezieren Sie die interessierenden Organe für weitere Ex-vivo-Analysen . Alternativ halten Sie das Tier für zukünftige In-vivo-Analysen am Leben. Entfernen Sie in diesem Fall die Beutelnaht, die den R.MIW hält, indem Sie sie mit einer Federschere schneiden, und lösen Sie den Fensterring vorsichtig mit stumpfen Pinzetten von der Maushaut. Reinigen Sie die Ränder der Haut, die zuvor das Fenster gehalten haben, und fahren Sie mit einer einfachen kontinuierlichen Naht fort (resorbierbares Material wie Polyglykolsäure). Sobald die Haut geschlossen ist, binden Sie die Anfangs- und Endnahtfäden mit zwei quadratischen Knoten (4 Würfe). Um die Gewebeischämie zu minimieren, sollten die Knoten locker genug sein, um den Blutfluss am Hautrand zu ermöglichen. Desinfizieren Sie die Wunde mit Povidon-Jod, um Entzündungen vorzubeugen und die Heilung der Haut zu fördern. Abbildung 3: IVM-Longitudinal-Workflow (A) Schematische Darstellung eines typischen mehrtägigen IVM-Experiments. (B) Bildgebung einer tumorigenen Region innerhalb der erwachsenen Brustdrüse. Vor jeder Bildgebungssitzung kann ein Übersichtskachel mit niedriger Auflösung (oberes Feld) die Identifizierung der Region(en) von Interesse an nachfolgenden Bildgebungstagen erleichtern. Das Kollagen-I-Muster (zweite harmonische Generation, Magenta), die Gewebestruktur und die Muster von differentiell markierten Zellen mit fluoreszierenden Proteinen (dargestellt in grün, gelb und rot) können verwendet werden, um den gleichen Gewebebereich nachzuzeichnen. Maßstabsbalken repräsentieren 1 mm (Übersichtskacheln) und 100 μm (untere Panels). (C) Schematische Darstellung des R26-Confetti-Reporterkonstrukts . Bei der Tamoxifen-induzierten Cre-Rekombination rekombiniert das Konfetti-Konstrukt stochastisch, was zur Expression eines der vier Fluorophore (nGFP, YFP, RFP oder mCFP) führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 5. Öffnen und Schließen des Deckels des R.MIW zwischen den Bildgebungssitzungen Bewahren Sie die Sterilität, indem Sie sterile Handschuhe verwenden, und sterilisieren Sie alle Gegenstände, die mit der Maus in Berührung kommen. Autoklavische chirurgische Werkzeuge vor der Operation (siehe Schritt 2 für Details). Schalten Sie das Heizkissen ein und bedecken Sie die Matte mit einem sterilen Tuch und betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit einem 3% Isofluran / O2-Gemisch. Überprüfen Sie eine angemessene Anästhesie, indem Sie einen Pfotenentzugsreflextest durchführen. Übertragen Sie die Maus aus der Induktionskammer auf eine Anästhesie-Nasenmaske und reduzieren Sie den Isofluran-Gehalt auf 1,5%-2% Isofluran/O2-Gemisch. Legen Sie die Spitzen der dünnen Pinzette durch die Löcher in den Armen des Deckels und lösen Sie den Deckel, indem Sie den Deckel gegen den Uhrzeigersinn drehen. Tragen Sie bei Bedarf etwas vorgewärmtes steriles PBS (37 °C) auf das Fenster auf, um das Lösen des Deckels zu erleichtern. Legen Sie den Deckel des R.MIW bis zur weiteren Verwendung in eine sterile Schale mit sterilem PBS. Reinigen Sie das Deckglas des Deckels mit Demi-Wasser und anschließend 80% Ethanol. Bewahren Sie den Deckel bis zur weiteren Verwendung in sterilem PBS auf. Verhindern Sie, dass das exponierte Gewebe austrocknet, indem Sie der Gewebeoberfläche einige Tropfen steriles PBS hinzufügen. Wenden Sie eine Substanz oder Zellen von Interesse auf das exponierte Gewebe an oder injizieren Sie sie, ein maximales Volumen von 50 μL kann verwendet werden. Warten Sie einige Minuten, bis die Flüssigkeit vom Gewebe aufgenommen wird. Alternativ kann das Gewebe mit sterilen, stumpfen Pinzetten manipuliert oder neu positioniert werden, um die Bildgebungsbedingungen für bestimmte ROIs zu optimieren. Tragen Sie Vaseline auf den inneren Rand des R.MIW auf und achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe zu vermeiden. Positionieren Sie den Deckel wie in Schritt 3.9 beschrieben in den R.MIW-Rahmen, platzieren Sie die Spitzen der dünnen Pinzetten durch die Löcher in den Armen des Deckels und ziehen Sie den Deckel fest, indem Sie den Deckel im Uhrzeigersinn drehen (ca. 5°).

Representative Results

Um die proliferative Dynamik von Brustepithelzellen während der verschiedenen Entwicklungsstadien der Brustdrüse zu untersuchen, wurde das beschriebene Protokoll durchgeführt. Das Design des R.MIW ist in Abbildung 1 dargestellt, und das Verfahren zur Implantation eines R.MIW ist in Abbildung 2 zusammengefasst. Der R.MIW wird chirurgisch zwischen der Brustdrüse und der Haut implantiert. Eine Naht wird verwendet, um innerhalb des Fensterrings zu halten und zu verhindern, dass die Mäuse an den Nähten ziehen (Abbildung 2). Die Nähte, die den R.MIW halten, bestehen aus nicht resorbierbarer Seide, die hypoallergene Eigenschaften hat, eine weiche Textur hat und einfach zu handhaben ist. Der R.MIW-Ring besteht aus Titan, einem der biokompatibelsten Materialien, die nach der Implantation keine Entzündungen oder Nekrosen fördern21. Wenn die aseptischen Bedingungen befolgt werden und die Nähte gut ausgeführt werden, stellt die R.MIW-Brustdrüsenimplantation ein geringes Risiko für postoperative Komplikationen dar. Darüber hinaus ist die R.MIW-Implantation im Gegensatz zur Implantation des abdominalen Bildgebungsfensters22 kein limitierender Faktor für das Überleben der Maus, da die Brustdrüse kein lebenswichtiges Organ ist und eine tägliche Bildgebung bis zu dem im ethischen Protokoll festgelegten Grenzwert ermöglicht. Der einzige Faktor, der die Dauer der Fensterimplantation begrenzt, ist der homöostatische Umschlag der Haut, der schließlich dazu führt, dass die Nähte nach 4 – 6 Wochen ausfallen. Daher ist es wichtig, die Stabilität der Nähte regelmäßig zu überprüfen. Auf Wunsch können die Nähte entfernt und unter aseptischen Bedingungen (wie in den Schritten 3.5 – 3.8 beschrieben) durch eine neue Geldbörsen-String-Naht ersetzt werden, um die Fensterstabilität zu gewährleisten. Eine große Herausforderung bei der Verwendung des mehrtägigen Bildgebungsansatzes besteht darin, einen ROI an aufeinanderfolgenden Tagen zurückzuverfolgen. Zu diesem Zweck kann vor der Auswahl der ROI(s) ein schneller Übersichtsscan eingefügt werden (Abbildung 3B). Mehrere Gewebe-Landmarken können verwendet werden, um die gleiche Region des Gewebes zurückzuverfolgen, einschließlich des Kollagennetzwerksignals (sichtbar durch zweite harmonische Generation), der Gewebestruktur sowie lokaler Muster von Zellen, die differentiell oder stochastisch mit Farbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen markiert sind (Abbildung 3B). In diesem repräsentativen Beispiel wurde ein R.MIW auf die 4. Brustdrüse eines MMTV-PyMT implantiert; R26-CreERT2het; R26-Konfettihet weibliche Maus zu Beginn der tastbaren Tumorbildung. Anschließend wurde die stochastische Rekombination durch Injektion von 1,5 mg Tamoxifen induziert, was in einigen Zellen zu einer Rekombination des Konfetti-Konstrukts führte (Abbildung 3C). Die rekombinierten Tumorzellen wurden über einen Zeitraum von 20 Tagen beobachtet (Abbildung 3B,C). Wenn die Abbildung derselben Region der Brustdrüse über aufeinanderfolgende Tage ausgeschlossen ist, kann das Fenster in einer aseptischen Umgebung geöffnet werden (wie in Schritt 5.1 beschrieben), um das Gewebe weiter aufzuräumen und neu zu positionieren, um die Sichtbarkeit und Bildaufnahme zu verbessern (Abbildung 3A). Mit dieser Methode wurde die sich entwickelnde Brustdrüse während der Pubertät auf Einzelzellebene beobachtet. Wiederholte IVM durch eine R.MIW wurde unter Verwendung von R26-CreERT2het durchgeführt; R26-mTmGhet weibliche Mäuse im Alter zwischen 4-6 Wochen, bei denen alle Zellen mit der Membran tdTomato markiert sind (Abbildung 4A)23. Den Mäusen wurde eine niedrige Dosis Tamoxifen (0,2 mg/25 g Körpergewicht) injiziert, was zu einer sporadischen Rekombination des mTmG-Konstrukts führte, was zu einer Veränderung von rot zu grün in einigen Zellen in allen Geweben, einschließlich der Brustdrüse, führte (Abbildung 4B). Die gleichen ROIs wurden über mehrere Tage hinweg erneut untersucht, um morphologische Veränderungen innerhalb der Brustdrüse zu visualisieren, einschließlich duktaler Dehnung und duktaler Verzweigung (Abbildung 4C) bei zellulärer Auflösung. Wichtig ist, dass diese Kombination aus stochastischer Zellmarkierung und mehrtägiger IVM auch die Visualisierung der dynamischen Veränderungen der duktalen Umgebung ermöglicht, wie z.B. die Dynamik einzelner Zellen im Stroma, das die länglichen und verzweigten Kanäle umgibt (Abbildung 4D) sowie die zelluläre Dynamik innerhalb des Leistenlymphknotens (Abbildung 4E). Abbildung 4: Mehrtägige IVM der pubertären Verzweigungsmorphogenese. (A) Pubertale R26-CreERT2; R26-mTmG-Mäusen im Alter zwischen 4-6 Wochen wurde eine niedrige Dosis Tamoxifen injiziert, was zu einer Cre-vermittelten Rekombination des R26-mTmG-Allels führte, und sie wurden an den Tagen 1, 3 und 5 abgebildet, um die dynamischen Veränderungen bei der Entwicklung der Brustdrüse zu verfolgen. (B) Schematische Darstellung des R26-mTmG-Mauskonstrukts , das unter nicht-rekombinierten Bedingungen zu einer allgegenwärtigen Expression der Membran-tdTomate (mT) führt. Bei Cre-vermittelter Rekombination wird mT für die Membran-eGFP (mG)-Expression geschaltet. (C) 3D-Darstellung eines länglichen und verzweigten Brustkanals über mehrere Tage, dargestellt durch einen R.MIW in einem R26-CreERT2; R26-mTmG weibliche Maus im Alter von 6 Wochen. (D) Einzelne Z-Ebenen-Bilder der Verzweigungsspitze (obere Tafeln) und des länglichen Astes (untere Tafeln). mT ist rot und mG in Cyan dargestellt, Maßstabsbalken repräsentieren 100 μm (A und B). Einzelne Zellen im Stroma werden durch weiße Sternchen hervorgehoben. Beachten Sie, dass die Signalintensität manuell erhöht wurde, um die einzelnen Zellen im Stroma hervorzuheben, was zu einem leicht überbelichteten Erscheinungsbild der Brustepithelzellen führte. (E) Repräsentative Bilder des Leistenlymphknotens eines R26-CreERT2; Die weibliche R26-mTmG-Maus , die durch einen R.MIW abgebildet wurde und einen Übersichtskachelscan (linkes Feld), Zoombilder (rechte Bereiche) einer einzelnen Z-Ebene (oben) und ein 3D-Rendering (unten) zeigt. Die zweite harmonische Generation (Kollagen I) ist in Grün, mT in Rot und mG in Cyan dargestellt. Maßstabsbalken stellen 500 μm (Übersichtskacheln) und 100 μm (Zoombilder) dar. Die Figurentafeln C und D sind modifiziert von Messal et al. 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. In ähnlicher Weise ermöglicht der vorgeschlagene R.MIW-Ansatz in der erwachsenen Brustdrüse die Visualisierung derselben duktalen Strukturen über mehrere Tage mit kompromissloser Sichtbarkeit. Selbst die Verwendung von weniger hellen fluoreszierenden Reportermodellen24, wie dem Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP ) Mausmodell, ermöglicht die Visualisierung der duktalen Stabilität und subtiler morphologischer Veränderungen bei zellulärer Auflösung (Abbildung 5). Beachten Sie, dass sich die Sichtbarkeit zwischen Tag 3 und Tag 5 nach der Neupositionierung des Gewebes signifikant verbessert hat (Abbildung 5). Abbildung 5: Mehrtägige Bildgebung der erwachsenen Brustdrüse . 3D-gerenderte Bilder einer mammarischen duktalen Struktur einer erwachsenen weiblichen Cdh1-mCFP-Maus (Cyan, Markierung der Ecadherin-positiven luminalen Zellexpression) Maus über mehrere aufeinanderfolgende Tage. Das Kollagen-I-Muster (zweite harmonische Generation, Magenta) wurde verwendet, um den gleichen ROI zurückzuverfolgen, und das Cdh1-mCFP-Signal wurde verwendet, um die duktalen (luminalen) Zellen zu markieren. Beachten Sie, dass die Sichtbarkeit nach Tag 3 durch das Öffnen des R.MIW-Deckels und die Neupositionierung des Gewebes verbessert wurde. Maßstabsbalken repräsentieren 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Um die proliferative Heterogenität der Brustepithelzellen während des Hormonzyklus auf Einzelzellebene zu beurteilen, wurde das photokonvertierbare Kikume Green-Red (KikGR) Reporter-Mausmodell25,26 verwendet, das eine allgegenwärtige Expression des KikGR-Proteins aufweist. KikGR ist ein heller Fluorophor, der bei Einwirkung von violettem Licht eine Umwandlung von Grün nach Rot erfährt, und das Rot/Grün-Verhältnis kann als Proxy für die proliferative Aktivität einerZelle 2 verwendet werden (Abbildung 6A, B). Mit dem R.MIW-Ansatz folgten wir den gleichen Zellen innerhalb des duktalen Baumes der adulten Brustdrüse über mehrere Tage und fanden zuvor unerwartete proliferative Heterogenität im gesamten duktalen Baum (Abbildung 6C). Zellen mit hoher und niedriger Proliferation waren gleichmäßig über die verschiedenen umgewandelten Bereiche verteilt (Abbildung 6C, D). Auffallend ist, dass benachbarte Zellen auf lokaler Ebene große Unterschiede in ihrem Rot/Grün-Verhältnis aufwiesen (Abbildung 6C,D). Die Quantifizierung des Rot/Grün-Verhältnisses verschiedener Zellen (als Proxy für ihre proliferative Aktivität) 10 Tage nach der Photokonversion ergab sehr variable Verdünnungsraten einiger Zellen innerhalb derselben duktalen Mikroumgebung (Abbildung 6E). Zusammengenommen zeigen diese Daten eine bemerkenswerte lokale proliferative Heterogenität innerhalb der erwachsenen Brustdrüse und gleichzeitig eine weltweit einheitliche Fluktuationsrate. Abbildung 6: Längsschnittliche IVM der proliferativen Heterogenität in der erwachsenen Brustdrüse unter Verwendung des KikGR-Mausmodells . (A) KikGR-Mäuse wurden am Tag 0 vor und nach der Exposition gegenüber violettem Licht aufgenommen. Die Bildgebungssitzungen wurden an den Tagen 2, 6 und 10 nach der Konvertierung wiederholt. (B) Schematische Darstellung der hypothetischen Ergebnisse bei der Photokonversion von KikGR-Brustepithelzellen nach Proliferation (linkes Bild) und keiner Proliferation (rechtes Bild) als Funktion der Zeit. (C) Der gleiche Bereich der Brustdrüse wurde über einen Zeitraum von 10 Tagen durch einen R.MIW abgebildet. Kleinere Regionen wurden am Tag 0 photokonvertiert und zeigen eine ähnliche Verdünnungsrate des roten Kikume-Signals im Laufe der Zeit, was auf eine gleiche Umschlagsrate im gesamten Epithel hinweist. (D) Zoombilder (einzelne Z-Ebenen) der angegebenen Regionen in Panel C zeigen 6 und 10 Tage nach der Fotokonvertierung proliferative Heterogenität auf zellulärer Ebene. Maßstabsbalken repräsentieren 100 μm (Panel C) und 10 μm (Panel D). (E) Quantifizierung des Rot/Grün-Verhältnisses von zufällig ausgewählten Zellen (n = 48 Zellen) in drei photokonvertierten Bereichen. Ein hohes Rot/Grün-Verhältnis weist auf eine niedrige Verdünnungsrate und eine geringe proliferative Aktivität hin, während ein niedriges Rot/Grün-Verhältnis auf eine hohe Verdünnungsrate und Proliferation hinweist. Die Figurentafeln C-E wurden gegenüber Messal et al. 2 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Das R.MIW ermöglicht die Längsbildgebung der gesunden und kranken Brustdrüse in ihrer nativen und minimal gestörten Umgebung und ermöglicht die wiederholte Visualisierung der Brustdrüse in verschiedenen Entwicklungsstadien. Das R.MIW-Design ermöglicht es, das Fenster an jedem Punkt des Experiments zu öffnen. Der langfristige visuelle Zugang zu dem interessierenden Gewebe kann beispielsweise durch die Ansammlung von Zellresten auf dem Deckglas behindert werden. In solchen Fällen kann der R.MIW vor oder unmittelbar nach einer Bildgebungssitzung geöffnet werden, um die Reinigung des gesamten sichtbaren Gewebebereichs und des Deckels zu ermöglichen. Der herausnehmbare Deckel ermöglicht auch Manipulationen des Gewebes sowie die lokale Anwendung von Substanzen wie spezifischen Inhibitoren und Therapien, Markierungsfarbstoffen oder bestimmten Zelltypen von Interesse.

Diese Methode überwindet die Einschränkung der zuvor beschriebenen Brusthautlappenverfahren 4,7,8,13, die auf eine bildgebende Sitzung beschränkt sind^, und kann Prozesse wie verzweigte Morphogenese (Abbildung 5), homöostatischen Gewebeumsatz (Abbildung 6) oder Tumorwachstum auf zellulärer Ebene sichtbar machen (Abbildung 3B ). Gleichzeitig ermöglicht der R.MIW jedoch die lokale Manipulation des ^Gewebes zwischen den Bildgebungssitzungen, was im Vergleich zum zuvor veröffentlichten MIW^3,18 und allen anderen Bildgebungsfenstern^20,22 einen großen Vorteil des R.MIW darstellt. Beim Öffnen des R.MIW ist es wichtig, jederzeit aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten, um eine Infektionsquelle zu verhindern. Die Möglichkeit, das R.MIW in einer aseptischen Umgebung zu öffnen, ermöglicht die Optimierung der Bildgebungsbedingungen vor jeder Bildgebungssitzung, was den langfristigen visuellen Zugang zu dem interessierenden Gewebe erheblich verbessert. Insbesondere in der Brustdrüse, die in ein adipozytenreiches Stroma eingebettet ist, ist dies von großem Wert. Darüber hinaus könnte der austauschbare Deckel auf einzigartige Weise die lokale Verabreichung von Therapeutika, verschiedenen Zelltypen, Markierungsfarbstoffen, bildgeführter Mikrodissektion oder einer anderen lokalen Manipulation des Gewebes ermöglichen, ohne dass das IVM-Experiment beendet werden muss. Um beispielsweise die Tumorinitiierung zu untersuchen, könnten spezifische Krebszellpopulationen direkt in den duktalen Baum oder das Stroma zu einem bestimmten IVM-Zeitpunkt und einer genauen Brustdrüsenposition injiziert werden, solange dieser ROI über den R.MIW-Ring zugänglich ist. Um die Tumorprogression zu untersuchen, könnten spezifische Krebszellpopulationen (an einem bestimmten Ort, in einer bestimmten Mikroumgebung oder mit einem bestimmten Verhalten) während der IVM-Sitzung photomarkiert und anschließend mit einem fluoreszierenden Dissektionsmikroskop nach dem Öffnen des R.MIW mikrodissektiert werden. Isolierte Zellen könnten für nachgelagerte Analysen wie die (einzellige) mRNA-Sequenzierung weiterverarbeitet werden. Mit diesem Ansatz könnte man das Verhalten von In-vivo-Zellen an molekulare Expressionsprofile koppeln. Der Vorteil der lokalen Arzneimittelverabreichung, der durch das R.MIW ermöglicht wird, ermöglicht es, das Gewebe vor und direkt nach der Behandlung abzubilden. Das Intervall, das benötigt wird, um die Maus aus der Bildgebungsbox zu entfernen und anschließend nach dem Öffnen des R.MIW-Deckels eine lokale Arzneimittelverabreichung durchzuführen, kann in wenigen Minuten durchgeführt werden, was die sofortige Phasenerfassung von schnell wirkenden Medikamenten ermöglicht.

Wir zeigen, dass IVM der Brustdrüse durch die R.MIW mit vielen verschiedenen fluoreszierenden Reporter-Mausmodellen kompatibel ist. Die adiposereiche Umgebung ist schwierig abzubilden, und daher wird die Verwendung von hellen Fluorophoren empfohlen. Wie hier gezeigt, können jedoch auch weniger helle Fluorophore wie mCFP durch das R.MIW unter optimalen Abbildungsbedingungen sichtbar gemacht werden. Unweigerlich wird das Fettpolster die Abbildung der tieferen duktalen Strukturen ausschließen und die Bildgebung auf die oberflächlicheren Kanäle beschränken. Ein niedrig aufgelöstes Übersichtsbild zu Beginn jedes IVM-Experiments hilft, die interessierenden duktalen Strukturen zu identifizieren, die für eine hochauflösende Bildgebung ausreichend oberflächlich sind. Lokale Gewebemanipulation, Entfernung von Bindegewebe oder Neupositionierung des Fettgewebes nach dem Öffnen des R.MIW können das IVM für bestimmte ROIs optimieren, die von Fettgewebe überlagert werden. Dies ist ein wichtiger Vorteil gegenüber allen bisherigen Fensterentwürfen, die diese Manipulationen nicht zulassen und eine vollständige Entfernung des Fensters selbst erfordern würden. Insbesondere zur Visualisierung des Leistenlymphknotens empfiehlt es sich, das darüber liegende Fettgewebe vorsichtig zu entfernen, was die Lichtstreuung reduziert und eine hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Halten Sie bei der Manipulation des Gewebes immer aseptische Bedingungen ein und verhindern Sie Blutungen oder schwere Schäden am Gewebe, da diese die während des IVM-Experiments untersuchten Prozesse beeinträchtigen können.

Der R.MIW besteht aus Titan, einem Material, das häufig in der klinischen Praxis verwendet wird, um Hartgewebe wie Gelenke oder Knochenplatten zu ersetzen. Titan hat mehrere Vorteile gegenüber Stahlfenstern, einschließlich seines leichten und inerten^{Charakters 21}. In jüngster Zeit wurden mehrere andere Materialien verwendet, um neuartige Bildgebungsfenstertypen zu erzeugen, darunter das flexible Siliziumfenster²⁰. Im Gegensatz zum R.MIW benötigt das flexible Fenster keine Nähte für die Implantation und eignet sich für nahezu jede anatomische Position, insbesondere bei weichem und zerbrechlichem Gewebe. Siliziumfenster haben aufgrund ihrer leichten und verformbaren Natur einen minimalen Einfluss auf die Motilität der Tiere und eignen sich möglicherweise besser für Experimente zur Untersuchung der schnellen Gewebeexpansion und des Wachstums²⁰. Ein weiterer Vorteil gegenüber der Titanversion ist, dass Siliziumfenster mit anderen Bildgebungsmodalitäten kompatibel sind, einschließlich Magnetresonanztomographie^20,27. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Objektive für 0,17 mm Glasabdeckungen optimiert sind. Darüber hinaus ist das Brustgewebe anfällig für Atembewegungen, die mit dem flexiblen Fenster schwer einzuschränken sind, insbesondere bei Verwendung eines umgekehrten Mikroskops. Atemartefakte werden durch das R.MIW-Design und die Fixierung des R.MIW in der Einlage der Bildgebungsbox minimiert. Infolgedessen werden Bilder, die mit dem vorgeschlagenen R.MIW-Setup aufgenommen wurden, nicht aufgrund von Atemartefakten verzerrt. Es können jedoch geringfügige Drifts in der Gewebelokalisation auftreten, die in der Regel allmählich verlaufen und mit der Bewegungskorrektursoftware nach der Erfassung^{korrigiert werden können 28}. Mit der zunehmenden Toolbox von IVM-Technologien ^2,20 werden die spezifischen Anforderungen für jedes Experiment letztendlich den besten Weg der In-vivo-Visualisierung des interessierenden Gewebes bestimmen. Unterschiedliche Fensterdesigns haben unterschiedliche Vor- und Nachteile und abhängig von der Forschungsfragestellung, dem verfügbaren mikroskopischen Aufbau, der erforderlichen räumlichen und zeitlichen Auflösung und der Gesamtzeitspanne des untersuchten Prozesses muss der optimale Ansatz bestimmt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das R.MIW eine hochauflösende Charakterisierung der Zelldynamik während der Entwicklung der Brustdrüse, der Homöostase und der Erkrankung über mehrere Tage bis Wochen ermöglicht.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Research Foundation Flanders (PhD Grant Fundamental Research 11L7222N to M.C.), der Boehringer Ingelheim Foundation (PhD Fellowship to C.L.G.J.S), einem EMBO Postdoctoral Fellowship (Grant ALTF 1035-2020 to C.L.G.J.S.) und dem Doctor Josef Steiner Award (an J.V.R.) unterstützt.

Materials

0.9% NaCl	BD	306573	Other brands available
10 mm round coverglass	Fisher scientific	10696365	Other brands available
5-0 braided silk suturs	Ethicon	W580
80% Ethanol	homemade	NA
Anesthesia induction box	Kentscientific	VetFlo-MSEKIT
Buprenorphine (Vetergesic®)	Ecuphar	NA
Cotton tips (sterile)	Fisher scientific	13113743	Other brands available
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	NA	Other brands available
Eye ointment	Duratears	NA
Flexible butterfly needle	Greiner Bio-One	450120	Other brands available
Graefe forceps (blunt)	Fine Science Tools	11051-10
Heating pad	Kentscientific	RightTemp Jr.	Other brands available
Imaging box	Custom made	NA
Infuse nutrient mixture	Braun	Nutriflex special 70/240
Insulin syringes	BD	324911	Other brands available
Inverted multi-photon microscope with automated stage	Leica Microsystems	NA
Isoflurane vaporizer	Kentscientific	VetFlo-1231K
Needle holder	Fine Science Tools	12510-14
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	semi-transparent tape
Paper tape tesa	Tesa	NA
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Razor blades	Fisher scientific	11904325	Other brands available
Silicon tubing	Solutions Elastomeres	NA	Any houseware
Spring scissors (small)	Fine Science Tools	15018-10
Sterile PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Syringe (10 ml)	BD	305482	Other brands available
Thin forceps	Fine Science Tools	11413-11
Titanium lid for mammary imaging window	Custom made	NA
Titanium mammary imaging window	Custom made	NA
Wooden sticks toothpicks	Fisher scientific	NC1678836	Other brands available

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Mourao, L., Ciwinska, M., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid. J. Vis. Exp. (179), e63326, doi:10.3791/63326 (2022).

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