Microscopie intravitale longitudinale à l’aide d’une fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable

Toutes les procédures décrites dans ce document ont été effectuées conformément aux directives de l’IACUC et de la KU Leuven et ont été effectuées dans le cadre de la demande de projet approuvée P160/2020. Avant d’exécuter ce protocole, veuillez examiner la stratégie d’analgésie avec le vétérinaire de l’établissement et administrer l’analgésie préopératoire et postopératoire conformément aux directives de l’établissement. 1. Préparation du R.MIW (délai estimé : 2 h) REMARQUE: Pour la construction du R.MIW, il est conseillé de trouver un fabricant local spécialisé dans le travail avec des matériaux durs tels que le titane, car cela nécessite des outils et une expertise spéciaux. Les ateliers spécialisés dans la conception et la fabrication de prothèses en titane disposent généralement de la machinerie et de l’expertise nécessaires pour produire les pièces R.MIW. Placez le couvercle du R.MIW sur une surface stérile avec l’extérieur du couvercle orienté vers le haut (et les bras du couvercle inclinés vers le bas; Figure 1A). Appliquez de la colle adhésive cyanoacrylate sur tout le bord du couvercle et placez soigneusement un couvercle en verre rond de 10 mm sur le dessus du couvercle.REMARQUE: Préparez toujours un couvercle de rechange avec un couvercle en verre comme sauvegarde pendant l’intervention chirurgicale. Utilisez un bâton en bois stérile pour positionner le couvercle en verre et appliquez une certaine force pour le pousser vers le bas afin d’assurer une étanchéité à l’air entre le couvercle en verre et le cadre du couvercle. Assurez-vous que les trous dans les bras du couvercle ne sont pas recouverts par le verre. Désinfectez les couvercles et le R.MIW en les immergeant dans de l’éthanol à 80% pendant au moins 30 min dans une boîte de Pétri fermée.REMARQUE: Ne laissez pas les couvercles plus de 1 h dans de l’éthanol à 80% pour éviter la dissolution de la colle adhésive cyanoacrylate. Retirez l’excès de colle adhésive cyanoacrylate du couvercle en verre à l’aide d’une pointe en coton imbibée d’acétone. Conservez les couvercles et le R.MIW dans un environnement stérile jusqu’à une utilisation ultérieure.REMARQUE: Le cadre et les couvercles R.MIW peuvent être conservés dans un tube ou un sac stérile pendant un maximum de 1 semaine. Lors de la reprise de l’expérience, vérifiez toujours si le couvercle en verre est toujours correctement fixé au couvercle avant de poursuivre le protocole. 2. Préparation à la chirurgie (durée estimée : 15 min) REMARQUE: Pour la procédure d’implantation R.MIW, des souris femelles (âgées de >3,5 semaines) de n’importe quelle souche peuvent être utilisées. Maintenez la stérilité en utilisant des gants stériles et stérilisez tous les articles qui entreront en contact avec la souris. Lavez les outils chirurgicaux avec de l’eau et du savon doux, séchez-les à l’air, enveloppez-les dans du papier d’aluminium sans coins ou bords exposés et stérilisez-les à l’aide d’un autoclave pendant un cycle de 20 minutes à 120 ° C avant la chirurgie. Préparez une plate-forme chirurgicale stérile et stérilisez les surfaces avec 80% d’éthanol.REMARQUE: Pour assurer la stérilité, la chirurgie peut être effectuée dans une armoire de flux. Allumez le coussin chauffant et couvrez le tapis avec un drap stérile. Disposez les instruments stériles sur le drap stérile et placez le R.MIW et au moins deux couvercles recouverts de verre dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de Pétri (fermez le couvercle pour éviter toute contamination externe). Anesthésier la souris dans une chambre d’induction à l’aide d’un mélange isoflurane/O2 à 3 %. Assurez-vous que l’animal est suffisamment détendu pour être facilement manipulé et transféré au masque nasal sans aucune lutte. Transférer la souris de la chambre d’induction à un masque nasal d’anesthésie et réduire le niveau d’isoflurane à 1,5% – 2% d’isoflurane / O2 mélange. Vérifiez l’anesthésie complète en effectuant un test de retrait de la patte. Pour effectuer le test de retrait de la patte, pincez fermement la patte de l’animal à l’aide d’ongles ou de pinces émoussées. En l’absence de tout réflexe musculaire, considérez l’animal comme inconscient et procédez à une préparation chirurgicale. Effectuez ce test avant la manipulation de l’animal et répétez régulièrement pendant les procédures anesthésiques et chirurgicales pour confirmer l’anesthésie. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la déshydratation de la cornée. Raser la zone autour de la 4e glande mammaire à l’aide d’une lame de rasoir (Figure 2A). Utilisez le 4ème mamelon comme point de repère. Enlevez les poils lâches à l’aide de ruban adhésif.REMARQUE: Alternativement, la crème dépilatoire peut être utilisée pour enlever les poils. Désinfectez la peau exposée avec de l’éthanol à 80% ou de la povidone-iode et placez la souris dans la zone chirurgicale stérile sur le dos avec le museau dans un masque nasal d’anesthésie en utilisant un mélange d’isoflurane / O2 à 1,5%. Fixez les membres avant et postérieurs de la souris à l’aide de ruban adhésif en papier.REMARQUE: Laissez la souris anesthésiée et récupératrice sur le coussin chauffant autant que possible, pendant et après la chirurgie. Utilisez un drap chirurgical stérile prédécoupé ou de la gaze pour couvrir la souris tout en laissant la zone chirurgicale exposée. 3. Implantation de R.MIW (durée estimée : 30 min) Vérifiez si l’animal est adéquatement anesthésié en effectuant un test de retrait des pattes. Soulevez doucement la peau à l’aide d’une pince Graefe fine et faites une incision de 10 à 15 mm de diagonale à l’aide de petits ciseaux à ressort dans la peau sur le dessus du 4ème coussinet graisseux mammaire en utilisant le 4ème mamelon comme point d’orientation (Figure 2A). Assurez-vous de ne pas couper ou endommager le péritoine ou la glande mammaire. Définissez la région d’intérêt (ROI) en fonction des caractéristiques macroscopiques du tissu mammaire, y compris l’emplacement du ganglion lymphatique ou d’une lésion tumorale, et essayez de garder le ROI central en ce qui concerne l’incision. Séparez la peau du coussinet adipeux mammaire et des couches tissulaires sous-jacentes à l’aide d’une dissection émoussée allant jusqu’à 5-8 mm tout autour de la ligne d’incision pour créer une poche adaptée au cadre R.MIW (Figure 2BI). Prenez le R.MIW à l’aide de pinces stériles et vérifiez si l’incision est assez grande pour insérer la fenêtre. Si nécessaire, agrandissez légèrement l’incision jusqu’à ce que le R.MIW s’insère. Retirez le R.MIW et placez une suture de cordon de bourse tout autour de l’incision à l’aide d’une suture en soie 5-0 (tressée, non résorbable). Placez la suture à 1-2 mm du bord de l’incision de l’extérieur vers l’intérieur de la peau, en commençant par l’extrémité caudale de l’incision. Déplacez-vous d’environ 5 mm le long de l’incision et passez le fil de suture à travers la peau de l’intérieur vers l’extérieur. Répétez cette procédure le long du bord de l’incision, créant ainsi une suture circulaire composée de 5 à 6 boucles (Figure 2BII). La sortie finale du fil de suture doit être située à environ 2-5 mm de la première entrée.REMARQUE: Veillez à ne pas placer la suture trop près du bord de l’incision, car cela augmente le risque de déchirure de la peau. Placer la suture trop loin du bord de l’incision augmente le risque d’infection entre l’excès de peau et le sillon du R.MIW. Insérez le R.MIW à l’intérieur de l’incision et utilisez les pinces Graefe pour placer soigneusement la peau dans la rainure du R.MIW. Assurez-vous de laisser les boucles de la suture à l’extérieur. Tirez sur les boucles de la suture du cordon de la bourse et resserrez la suture dans la rainure du R.MIW en tirant doucement sur les deux extrémités de la suture (Figure 2BIII). Attachez-vous avec des nœuds chirurgicaux et coupez l’excès de fil. Appliquez de la vaseline sur le bord intérieur du R.MIW à l’aide d’un cure-dent, tout en vous assurant d’éviter le tissu sous-jacent. Poussez doucement le cadre de la fenêtre vers le bas avec des pinces stériles ou deux doigts, puis placez le couvercle dans le cadre R.MIW (Figure 1B). Cela évitera un volume d’air entre le tissu de la glande mammaire et le couvercle R.MIW. Placez les extrémités des pinces minces à travers les trous dans les bras du couvercle et serrez le couvercle en tordant le couvercle dans le sens des aiguilles d’une montre (environ 5°) (Figure 1C et Figure 2BIV). S’il reste un peu d’air après avoir resserré le couvercle du R.MIW, utilisez une aiguille à insuline stérile pour éliminer l’excès d’air. Introduisez l’aiguille à travers la peau dans la cavité entre le tissu mammaire et la paupière et retirez lentement le piston, créant ainsi un vide entre le tissu de la glande mammaire et le couvercle R.MIW. Administrer, après la chirurgie, une analgésie telle que la buprénorphine (0,1 mg/kg dilué dans du NaCl stérile à 0,9 %) par injection sous-cutanée. Répéter l’injection sous-cutanée de buprénorphine à 8 h et 16 h après la chirurgie. Remettez la souris dans la cage pour récupérer et surveiller de près jusqu’à ce qu’elle soit complètement éveillée, ou passez à l’étape 4 pour une imagerie immédiate. À ce stade post-chirurgical, surveillez de près les souris pour détecter tout signe d’inconfort ou de complications en fonction de paramètres vitaux, tels que la respiration, la réactivité, le comportement, la posture et le poids corporel. Surveillez attentivement la peau entourant la fenêtre pour détecter tout signe d’inflammation et de nécrose. Si aucune complication ne se produit, le R.MIW permettra des séances répétées de MIV sur plusieurs semaines après l’implantation. Figure 2: Aperçu de l’intervention chirurgicale et de l’implantation de la fenêtre. (A) Une incision diagonale est pratiquée près du 4 e mamelon d’une souris femelle et la peau et le tissu sous-jacent sont déconnectés par dissection contondante. (B) Le ganglion lymphatique inguinal et la forme du coussinet adipeux peuvent être utilisés pour la bonne orientation du tissu (I). Une suture de cordon de bourse est placée dans la peau autour de l’incision (II), et après ajustement dans le cadre de la fenêtre, la suture est serrée dans la rainure pour sécuriser le cadre de la fenêtre et sécurisée par des nœuds chirurgicaux (III). La dernière étape est l’insertion et le verrouillage du couvercle dans le cadre de la fenêtre (IV). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 4. Microscopie intravitale répétée à travers le R.MIW REMARQUE: La stratégie IVM répétée décrite ici a été optimisée pour un système confocal multiphoton inversé équipé d’un étage motorisé et d’une chambre climatique sombre à 35,8 ° C. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction à l’aide d’un mélange isoflurane/O2 à 3 %. Vérifiez la perte de conscience en effectuant un test de retrait de la patte (décrit à l’étape 2.6). Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la déshydratation de la cornée pendant la séance d’imagerie. Inspectez l’état du cadre et du couvercle R.MIW, y compris la stabilité des sutures ou tout dommage potentiel au couvercle. En cas d’endommagement du couvercle, le couvercle peut être remplacé comme décrit à l’étape 5. Transférez la souris dans une boîte d’imagerie préchauffée (37 °C) (Figure 3A) et placez la souris avec la tête dans le cône du nez. La boîte d’imagerie se compose d’un cadre qui s’insère dans l’étage automatisé du microscope. Le cadre est conçu pour contenir une incrustation sur mesure avec un trou du diamètre du R.MIW (Figure 3A). Une entrée avec un cône de nez est connectée à l’avant de la boîte et fixée à une station de vaporisateur d’isoflurane en utilisant un mélange isoflurane/O2 à 2 % à 2 %. Une sortie est reliée à une unité de piégeage anesthésique pour assurer la circulation et empêcher l’accumulation d’isoflurane dans la boîte. La boîte d’imagerie peut être fermée à l’aide d’un couvercle transparent. Positionnez la souris sur l’incrustation de manière à ce que le R.MIW tombe dans le trou de l’incrustation de la boîte d’imagerie (Figure 3A). Appliquez un parafilm et du ruban adhésif en papier sur le dos de la souris pour stabiliser la souris et réduire le mouvement des tissus dû à la respiration. Fermez la boîte d’imagerie avec le couvercle et insérez la boîte d’imagerie dans la scène du microscope. Réduire progressivement la dose d’isoflurane au cours de la séance d’imagerie pour maintenir une anesthésie stable mais superficielle (généralement entre 1,5% et 0,8% d’isoflurane / O2 mélange). Fournir une nutrition adéquate pendant l’imagerie comme décrit ci-dessous. Pour les séances d’imagerie <3 h, injecter à la souris par voie sous-cutanée 200-300 μL de PBS stérile pour l’hydratation. Pour les séances d’imagerie >3 h, suivez les étapes décrites ci-dessous. Pour l’imagerie à long terme, infuser la souris avec des nutriments. Pour cela, utilisez un mélange d’infusion stérile disponible dans le commerce contenant des acides aminés et du glucose. Placez une aiguille flexible par voie sous-cutanée dans le cou de la souris et fixez-la avec du ruban adhésif en papier. Fixez une seringue de 10 ml avec le mélange de nutriments préparé à un tube de silicium flexible et poussez le mélange de nutriments jusqu’à ce qu’il ait atteint l’extrémité du tube. Connectez le tube de silicone à l’aiguille flexible. Prenez l’extrémité du tube et placez-le à travers l’un des trous de la boîte d’imagerie (de l’intérieur vers l’extérieur, en laissant le côté de fixation de l’aiguille dans la boîte). Injecter 50 μL de solution d’infusion toutes les 30 minutes. Fixez la boîte d’imagerie dans la scène du microscope et définissez la zone d’intérêt en utilisant le mode d’épifluorescence du microscope. Appliquez les paramètres de microscope souhaités en fonction du modèle de souris (Figure 3B). Les structures des vaisseaux, les modèles de collagène (visualisés par la deuxième génération harmonique) et d’autres structures anatomiques stables, y compris le ganglion lymphatique inguinal, peuvent être utilisés comme points de repère. Obtenez des images à l’aide d’un microscope confocal multiphoton inversé à une profondeur de 12 bits et d’un objectif d’eau 25x utilisant une taille de pas Z allant de 1,0 à 4,0 μm (pile z totale allant de 150 à 800 μm). Appliquez les paramètres standard suivants : format 1024 x 1024, vitesse de numérisation de 600 Hz, mode bidirectionnel. Visualisez les fibres de collagène I en effectuant une deuxième génération harmonique en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 860 nm et une détection à 425-435 nm. Les longueurs d’onde d’excitation et de détection des différents fluorophores sont indiquées dans le tableau 1. Tableau 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. Utilisez la fonction Spirale en mode navigateur du logiciel d’imagerie pour générer un grand aperçu de tilescan afin de créer une carte de référence du tissu (Figure 3B). Définissez les retours sur investissement dans la vue d’ensemble en spirale, définissez les plans Z supérieur et inférieur pour déterminer la pile Z. Appuyez sur Démarrer pour obtenir des piles Z tridimensionnelles (xyz) ou quadridimensionnelles (xyzt) détaillées du tissu.REMARQUE: Pendant toute l’expérience d’imagerie, la souris doit être étroitement surveillée. Pour les longues séances d’imagerie, un oxymètre de pouls et une sonde de température sont recommandés. La respiration de la souris doit être régulière et au même rythme. Si la souris commence à montrer des signes de halètement, la quantité d’isoflurane doit être réduite. À la fin de chaque séance d’imagerie, gardez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement éveillée. Si la souris montre des signes d’inconfort ou de mobilité réduite, gardez la cage plus longtemps sur le coussin chauffant et fournissez des gels nutritifs au lieu du chow régulier.REMARQUE: Entre les séances d’imagerie, la souris doit être étroitement surveillée pour détecter des signes d’inconfort tels qu’une diminution de la consommation de nourriture et d’eau, une respiration rapide, une diminution des mouvements, des tremblements, une posture corporelle anormale ou une fourrure non entretenue. En cas de signes évidents d’inconfort, suivez les directives institutionnelles concernant le bien-être des animaux et mettez fin à l’expérience lorsque le critère d’évaluation sans cruauté est atteint. Répétez les étapes 4.1 à 4.12 pour chaque session d’imagerie répétée et utilisez le tilescan de vue d’ensemble pour retracer la ou les mêmes positions sur plusieurs points temporels (Figure 3B). La fréquence d’imagerie dépendra de la question de recherche et du moment du processus étudié, et varie généralement de séances d’imagerie deux fois par jour à une fois par semaine. À la fin de la période expérimentale souhaitée, euthanasier les animaux avec un R.MIW implanté en utilisant une anesthésie profonde à l’isoflurane suivie d’une luxation cervicale. Si vous le souhaitez, disséquez les organes d’intérêt pour d’autres analyses ex vivo . Alternativement, gardez l’animal en vie pour de futures analyses in vivo . Dans ce cas, retirez la suture de la poche qui maintient le R.MIW en la coupant avec des ciseaux à ressort et détachez soigneusement l’anneau de fenêtre de la peau de la souris à l’aide de pinces émoussées. Nettoyez les bords de la peau qui tenait auparavant la fenêtre et procédez à une simple suture continue (matériau résorbable, tel que l’acide polyglycolique). Une fois la peau fermée, attachez les fils de suture de début et de fin avec deux nœuds carrés (4 lancers). Pour minimiser l’ischémie tissulaire, les nœuds doivent être suffisamment lâches pour permettre la circulation sanguine au bord de la peau. Désinfectez la plaie avec de la povidone-iode pour prévenir l’inflammation et favoriser la cicatrisation de la peau. Figure 3 : Flux de travail IVM longitudinal. (A) Représentation schématique d’une expérience IVM typique de plusieurs jours. (B) Imagerie d’une région tumorigène dans la glande mammaire adulte. Avant chaque séance d’imagerie, un tilescan de vue d’ensemble à basse résolution (panneau supérieur) peut faciliter l’identification de la ou des régions d’intérêt au cours des jours d’imagerie suivants. Le motif de collagène I (deuxième génération harmonique, magenta), la structure tissulaire et les motifs de cellules marquées différentiellement avec des protéines fluorescentes (représentés en vert, jaune et rouge) peuvent être utilisés pour retracer la même zone tissulaire. Les barres d’échelle représentent 1 mm (vue d’ensemble tilescan) et 100 μm (panneaux inférieurs). (C) Représentation schématique de la construction du rapporteur R26-Confetti. Lors de la recombinaison de la créo-induisant le tamoxifène, les confettis construisent des recombinaisons stochastiques, ce qui entraîne l’expression de l’un des quatre fluorophores (nGFP, YFP, RFP ou mCFP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 5. Ouverture et fermeture du couvercle du R.MIW entre les séances d’imagerie Maintenez la stérilité en utilisant des gants stériles et stérilisez tous les articles qui entreront en contact avec la souris. Outils chirurgicaux autoclaves avant la chirurgie (voir l’étape 2 pour plus de détails). Allumez le coussin chauffant et couvrez le tapis avec un drap stérile et anesthésiez la souris dans une chambre à induction en utilisant un mélange isoflurane/O2 à 3%. Vérifiez une anesthésie adéquate en effectuant un test réflexe de retrait de la patte. Transférer la souris de la chambre d’induction à un masque nasal d’anesthésie et réduire le niveau d’isoflurane à 1,5%-2% d’isoflurane / O2 mélange. Placez les pointes des pinces minces à travers les trous dans les bras du couvercle et desserrez le couvercle en tordant le couvercle dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Si nécessaire, appliquez du PBS stérile préchauffé (37 °C) sur la fenêtre pour faciliter le desserrage du couvercle. Placez le couvercle du R.MIW dans un plat stérile avec du PBS stérile jusqu’à une utilisation ultérieure. Nettoyez le verre de couverture du couvercle avec de la demi-eau et ensuite de l’éthanol à 80%. Gardez le couvercle dans du PBS stérile jusqu’à nouvel emploi. Empêchez les tissus exposés de se dessécher en ajoutant quelques gouttes de PBS stérile à la surface des tissus. Appliquer ou injecter toute substance ou cellules d’intérêt sur le tissu exposé, un volume maximum de 50 μL peut être utilisé. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que le liquide soit absorbé par le tissu. Alternativement, le tissu peut être manipulé ou repositionné à l’aide de pinces stériles et contondantes pour optimiser les conditions d’imagerie pour des retours sur investissement spécifiques. Appliquez de la vaseline sur le bord intérieur du R.MIW, en veillant à éviter le tissu sous-jacent. Placez le couvercle dans le cadre R.MIW comme décrit à l’étape 3.9, placez les extrémités des pinces minces à travers les trous dans les bras du couvercle et serrez le couvercle en le tordant dans le sens des aiguilles d’une montre (environ 5 °).