Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

Alle in dit document beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het IACUC en de KU Leuven en werden uitgevoerd in het kader van de goedgekeurde projectaanvraag P160/2020. Voordat u dit protocol uitvoert, moet u de analgesiestrategie met de institutionele dierenarts doornemen en pre- en postoperatieve analgesie toedienen volgens de institutionele richtlijnen. 1. Voorbereiding van de R.MIW (geschatte timing: 2 uur) OPMERKING: Voor de constructie van de R.MIW is het raadzaam om een lokale fabrikant te vinden die gespecialiseerd is in het werken met harde materialen zoals titanium, omdat dit speciale gereedschappen en expertise vereist. Werkplaatsen die gespecialiseerd zijn in het ontwerp en de productie van titaniumprothesen hebben meestal de machines en expertise om de R.MIW-onderdelen te produceren. Plaats het deksel van de R.MIW op een steriel oppervlak met de buitenkant van het deksel naar boven gericht (en de armen van het deksel schuin naar beneden; Figuur 1A). Breng cyanoacrylaatlijm aan rond de hele rand van het deksel en plaats voorzichtig een 10 mm ronde glazen afdekplaat op het deksel.OPMERKING: Bereid altijd een reservedeksel voor met een glazen afdeksel als back-up tijdens de chirurgische ingreep. Gebruik een steriele houten stok om de glazen afdekplaat te positioneren en oefen wat kracht uit om deze naar beneden te duwen om een luchtdichte afdichting tussen de glazen afdekplaat en het frame van het deksel te garanderen. Zorg ervoor dat de gaten in de armen van het deksel niet worden afgedekt door het glas. Desinfecteer de deksels en de R.MIW door gedurende ten minste 30 minuten onder te dompelen in 80% ethanol in een gesloten petrischaal.OPMERKING: Laat de deksels niet langer dan 1 uur in 80% ethanol om het oplossen van de cyanoacrylaatlijmlijm te voorkomen. Verwijder de overtollige cyanoacrylaatlijm van de glazen afdekplaat met behulp van een katoenen punt gedrenkt in aceton. Bewaar de deksels en de R.MIW in een steriele omgeving tot verder gebruik.LET OP: Het R.MIW frame en deksels zijn maximaal 1 week in een steriele buis of zak te bewaren. Controleer bij het hervatten van het experiment altijd of de glazen afdekplaat nog steeds goed aan het deksel is bevestigd voordat u doorgaat met het protocol. 2. Voorbereiding op de operatie (geschatte timing: 15 min) OPMERKING: Voor de R.MIW-implantatieprocedure kunnen vrouwelijke muizen (>3,5 weken oud) van elke stam worden gebruikt. Behoud de steriliteit door steriele handschoenen te gebruiken en steriliseer alle items die in contact komen met de muis. Was chirurgische gereedschappen met water en milde zeep, droog aan de lucht, wikkel in aluminiumfolie zonder blootgestelde hoeken of randen en steriliseer met behulp van een autoclaaf gedurende een cyclus van 20 minuten bij 120 °C voorafgaand aan de operatie. Bereid een steriel chirurgisch platform voor en steriliseer de oppervlakken met 80% ethanol.OPMERKING: Om steriliteit te garanderen, kan de operatie worden uitgevoerd in een stroomkast. Zet het verwarmingskussen aan en bedek de mat met een steriel gordijn. Plaats de steriele instrumenten op het steriele gordijn en plaats de R.MIW en minimaal twee met glas bedekte deksels in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaaltje (sluit het deksel om externe besmetting te voorkomen). Verdoof de muis in een inductiekamer met behulp van een 3% isofluraan/O2 mengsel. Zorg ervoor dat het dier ontspannen genoeg is om gemakkelijk te worden gemanipuleerd en zonder enige moeite op het neusmasker te worden overgebracht. Breng de muis over van de inductiekamer naar een anesthesie neusmasker en verlaag het isofluraangehalte tot 1,5% – 2% isofluraan/O2 mengsel. Controleer de volledige anesthesie door een pootontwenningstest uit te voeren. Om de pootonttrekkingstest uit te voeren, knijpt u stevig in de dierenpoot met vingernagels of stompe eindtangen. Bij afwezigheid van een spierreflex, beschouw het dier als bewusteloos en ga over tot chirurgische voorbereiding. Voer deze test uit vóór diermanipulatie en herhaal regelmatig tijdens de verdoving en chirurgische procedures om de anesthesie te bevestigen. Breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Scheer het gebied rond de4e borstklier met een scheermesje (figuur 2A). Gebruik de4e tepel als oriëntatiepunt. Verwijder losse haren met plakband.OPMERKING: Als alternatief kan ontharingscrème worden gebruikt om de haren te verwijderen. Desinfecteer de blootgestelde huid met 80% ethanol of povidon-jodium en plaats de muis in het steriele chirurgische gebied op zijn rug met de snuit in een anesthesieneusmasker met behulp van 1,5% isofluraan / O2-mengsel . Bevestig de voorste en achterpoten van de muis met papieren tape.OPMERKING: Laat de verdoofde en herstellende muis zoveel mogelijk op het verwarmingskussen liggen, tijdens en na de operatie. Gebruik een voorgesneden steriel chirurgisch gordijn of gaas om de muis te bedekken terwijl het chirurgische gebied bloot blijft. 3. R.MIW implantatie (geschatte timing: 30 min) Controleer of het dier voldoende verdoofd is door een pootonttrekkingstest uit te voeren. Til de huid voorzichtig op met een fijne Graefe-tang en maak een diagonale incisie van 10-15 mm met een kleine veerschaar in de huid bovenop het4e borstvetkussen met behulp van de4e tepel als oriëntatiepunt (figuur 2A). Zorg ervoor dat u het buikvlies of de borstklier niet snijdt of beschadigt. Definieer het interessegebied (ROI) op basis van macroscopische kenmerken van het borstweefsel, inclusief de locatie van de lymfeklier of een tumorlaesie, en probeer de ROI centraal te houden met betrekking tot de incisie. Scheid de huid van het borstvetkussen en de onderliggende weefsellagen met behulp van een stompe dissectie van maximaal 5-8 mm rondom de incisielijn om een zak te creëren die past bij het R.MIW-frame (figuur 2BI). Pak de R.MIW op met een steriele tang en test of de incisie groot genoeg is om het venster in te brengen. Vergroot indien nodig de incisie enigszins totdat de R.MIW erin past. Verwijder de R.MIW en plaats een ring-string hechting rondom de incisie met behulp van een 5-0 zijden hechtdraad (gevlochten, niet-resorbeerbaar). Plaats de hechting 1-2 mm van de rand van de incisie van de buitenkant naar de binnenkant van de huid, beginnend bij het caudale uiteinde van de incisie. Beweeg ongeveer 5 mm omhoog langs de incisie en laat de hechtdraad van binnen naar buiten door de huid lopen. Herhaal deze procedure langs de rand van de incisie, waardoor een cirkelvormige hechting ontstaat die bestaat uit 5-6 lussen (figuur 2BII). De uiteindelijke uitgang van de hechtdraad moet zich op ongeveer 2-5 mm afstand van de eerste ingang bevinden.OPMERKING: Zorg ervoor dat u de hechting niet te dicht bij de rand van de incisie plaatst, omdat dit het risico op huidscheur verhoogt. Het plaatsen van de hechting te ver van de rand van de incisie verhoogt het risico op infectie tussen de overtollige huid en de groef van de R.MIW. Plaats de R.MIW in de incisie en gebruik de Graefe-tang om de huid voorzichtig in de groef van de R.MIW te plaatsen. Zorg ervoor dat u de lussen van de hechting buiten laat. Trek aan de lussen van de tas-snaar hechting en span de hechting in de groef van de R.MIW aan door voorzichtig aan beide uiteinden van de hechtdraad te trekken (figuur 2BIII). Knoop af met chirurgische knopen en knip de overtollige draad weg. Breng vaseline aan op de binnenrand van de R.MIW met behulp van een tandenstoker, terwijl u ervoor zorgt dat het onderliggende weefsel wordt vermeden. Duw het raamkozijn voorzichtig naar beneden met een steriele tang of twee vingertoppen en plaats het deksel in het R.MIW-frame (figuur 1B). Dit voorkomt een hoeveelheid lucht tussen het borstklierweefsel en het R.MIW-deksel. Plaats de uiteinden van een dunne tang door de gaten in de armen van het deksel en draai het deksel vast door het deksel met de klok mee te draaien (ongeveer 5°) (figuur 1C en figuur 2BIV). Als er wat lucht achterblijft na het aandraaien van het R.MIW-deksel, gebruik dan een steriele insulinenaald om de overtollige lucht te verwijderen. Breng de naald door de huid in de holte tussen het borstweefsel en het deksel en trek langzaam de zuiger eruit, waardoor een vacuüm ontstaat tussen het borstklierweefsel en het R.MIW-deksel. Dien na de operatie analgesie toe, zoals buprenorfine (0,1 mg/kg verdund in steriele 0,9% NaCl) door subcutane injectie. Herhaal subcutane injectie met buprenorfine na 8 uur en 16 uur na de operatie. Plaats de muis terug in de kooi om te herstellen en nauwlettend te controleren totdat hij volledig wakker is, of ga verder met stap 4 voor onmiddellijke beeldvorming. Controleer in dit postoperatieve stadium de muizen nauwlettend op tekenen van ongemak of complicaties op basis van vitale parameters, zoals ademhaling, reactiviteit, gedrag, houding en lichaamsgewicht. Controleer de huid rond het venster zorgvuldig op tekenen van ontsteking en necrose. Als er geen complicaties optreden, zal de R.MIW herhaalde IVM-sessies mogelijk maken gedurende enkele weken na implantatie. Figuur 2: Overzicht van de chirurgische ingreep en raamimplantatie. (A) Een diagonale incisie wordt gemaakt in de buurt van de4e tepel van een vrouwelijke muis en de huid en het onderliggende weefsel worden losgekoppeld door stompe dissectie. (B) De inguinale lymfeklier en vorm van het vetkussen kunnen worden gebruikt voor de juiste oriëntatie van het weefsel (I). Een tas-string hechting wordt in de huid rond de incisie (II) geplaatst en na het plaatsen van het raamkozijn wordt de hechting in de groef aangespannen om het raamkozijn vast te zetten en beveiligd door chirurgische knopen (III). De laatste stap is het inbrengen en vergrendelen van het deksel in het raamkozijn (IV). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Herhaalde intravitale microscopie via de R.MIW OPMERKING: De herhaalde IVM-strategie die hier wordt beschreven, is geoptimaliseerd voor een omgekeerd multifotonen confocaal systeem uitgerust met een gemotoriseerd podium en een donkere klimaatkamer bij 35,8 °C. Verdoof de muis in een inductiekamer met behulp van een 3% isofluraan/O2 mengsel. Controleer het bewustzijnsverlies door een pootonttrekkingstest uit te voeren (beschreven in stap 2.6). Breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies tijdens de beeldvormingssessie te voorkomen. Inspecteer de staat van het R.MIW-frame en deksel, inclusief de stabiliteit van de hechtingen of mogelijke schade aan het deksel. In geval van schade aan het deksel kan het deksel worden vervangen zoals beschreven in stap 5. Breng de muis over naar een voorverwarmde (37 °C), op maat gemaakte beeldbuis (figuur 3A) en plaats de muis met de kop in de neuskegel. De imaging box bestaat uit een frame dat past binnen het geautomatiseerde stadium van de microscoop. Het frame is ontworpen om een op maat gemaakte inlay te houden met een gat met de diameter van de R.MIW (figuur 3A). Een inlaat met een neuskegel is verbonden met de voorkant van de doos en bevestigd aan een isofluraan vaporizer station met behulp van 2% -3% isofluraan / O2 mengsel. Een uitlaat is aangesloten op een anestheticum opruimingseenheid om de circulatie te garanderen en ophoping van isofluraan in de doos te voorkomen. De beeldvormende doos kan worden gesloten met behulp van een transparant deksel. Plaats de muis op de inlay zodanig dat de R.MIW in het gat van de inlay van de beelddoos valt (figuur 3A). Breng parafilm en papieren tape aan op de achterkant van de muis om de muis te stabiliseren en de beweging van het weefsel als gevolg van ademhaling te verminderen. Sluit de beeldvormende doos met het deksel en plaats de afbeeldingsdoos in het stadium van de microscoop. Verlaag de dosis isofluraan geleidelijk in de loop van de beeldvormingssessie om een stabiele, maar oppervlakkige anesthesie te behouden (meestal tussen 1,5% -0,8% isofluraan / O2-mengsel ). Zorg voor de juiste voeding tijdens de beeldvorming zoals hieronder beschreven. Voor beeldvormingssessies <3 uur, injecteer de muis subcutaan met 200-300 μL steriel PBS voor hydratatie. Voor beeldvormingssessies >3 uur volgt u de onderstaande stappen. Voor beeldvorming op lange termijn, infundeer de muis met voedingsstoffen. Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbaar steriel infuse mengsel dat aminozuren en glucose bevat. Plaats een flexibele naald subcutaan in de nek van de muis en bevestig deze met papieren tape. Bevestig een spuit van 10 ml met de bereide voedingsmix aan een flexibele siliconenbuis en duw de voedingsmix door totdat deze het einde van de buis heeft bereikt. Sluit de siliconen buis aan op de flexibele naald. Neem het uiteinde van de buis en plaats deze door een van de gaten van de beeldvormende doos (van binnen naar buiten, waarbij de naaldbevestigingszijde in de doos blijft). Injecteer elke 30 min 50 μL infuse-oplossing. Bevestig de beelddoos in het stadium van de microscoop en definieer het interessegebied met behulp van de epifluorescentiemodus van de microscoop. Pas de gewenste microscoopinstellingen toe, afhankelijk van het muismodel (figuur 3B). Vaatstructuren, collageenpatronen (gevisualiseerd door de tweede harmonische generatie) en andere stabiele anatomische structuren, waaronder de inguinale lymfeklier, kunnen als oriëntatiepunten worden gebruikt. Verkrijg beelden met behulp van een omgekeerde multifoton confocale microscoop op een 12-bits diepte en een 25x waterobjectief met behulp van een Z-stapgrootte variërend van 1,0 tot 4,0 μm (totale z-stack variërend van 150 tot 800 μm). Pas de volgende standaardinstellingen toe: 1024 x 1024-indeling, 600 Hz scansnelheid, bidirectionele modus. Visualiseer collageen I-vezels door een tweede harmonische generatie uit te voeren met behulp van een excitatiegolflengte van 860 nm en detectie bij 425-435 nm. Excitatie- en detectiegolflengten voor de verschillende fluoroforen zijn aangegeven in tabel 1. Tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden. Gebruik de spiral-functie in de navigatormodus van de beeldvormingssoftware om een groot overzicht te genereren om een referentiekaart van het weefsel te maken (figuur 3B). Definieer de ROI’s in het spiraaloverzicht, definieer de bovenste en onderste Z-vlakken om de Z-stack te bepalen. Druk op Start om gedetailleerde driedimensionale (xyz) of vierdimensionale Z-stacks (xyzt) van het weefsel te verkrijgen.OPMERKING: Tijdens het gehele beeldvormingsexperiment moet de muis nauwlettend in de gaten worden gehouden. Voor lange beeldvormingssessies worden een pulsoximeter en temperatuursonde aanbevolen. De ademhaling van de muis moet regelmatig en in hetzelfde tempo zijn. Als de muis tekenen van hijgen begint te vertonen, moet de hoeveelheid isofluraan worden verminderd. Houd aan het einde van elke beeldvormingssessie de muis op een verwarmingskussen totdat hij volledig wakker is. Als de muis tekenen van ongemak of verminderde mobiliteit vertoont, houd de kooi dan langer op het verwarmingskussen en zorg voor voedingsgels in plaats van de gewone chow.OPMERKING: Tussen de beeldvormingssessies door moet de muis nauwlettend worden gecontroleerd op tekenen van ongemak, zoals verminderde voedsel- en waterconsumptie, snelle ademhaling, verminderde beweging, tremor, abnormale lichaamshouding of een niet-gebroken vacht. In geval van duidelijke tekenen van ongemak, volg de institutionele richtlijnen met betrekking tot dierenwelzijn en beëindig het experiment wanneer het humane eindpunt is bereikt. Herhaal stap 4.1-4.12 voor elke herhaalde beeldvormingssessie en gebruik de overzichtstegelscan om dezelfde positie(s) over meerdere tijdstippen te volgen (figuur 3B). De frequentie van beeldvorming is afhankelijk van de onderzoeksvraag en de timing van het bestudeerde proces en varieert meestal van beeldvormingssessies twee keer per dag tot één keer per week. Aan het einde van de gewenste experimentele periode, euthanaseer de dieren met een geïmplanteerde R.MIW met behulp van diepe anesthesie met isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie. Ontleed desgewenst de organen van belang voor verdere ex vivo analyses. U kunt het dier ook in leven houden voor toekomstige in vivo analyses. Verwijder in dat geval de buidelbevestiging die de R.MIW vasthoudt door deze met een veerschaar te knippen en maak de raamring voorzichtig los van de muizenhuid met een stompe tang. Reinig de randen van de huid die eerder het venster vasthielden en ga verder met een eenvoudige continue hechting (absorbeerbaar materiaal, zoals polyglycolzuur). Zodra de huid gesloten is, bindt u de begin- en eindnaaddraden met twee vierkante knopen (4 worpen). Om weefselischemie te minimaliseren, moeten de knopen los genoeg zijn om de bloedstroom aan de huidrand mogelijk te maken. Desinfecteer de wond met povidon-jodium om ontstekingen te voorkomen en de genezing van de huid te bevorderen. Figuur 3: Longitudinale IVM-workflow. (A) Schematische weergave van een typisch meerdaags IVM-experiment. (B) Beeldvorming van een tumorigen gebied in de volwassen borstklier. Voorafgaand aan elke beeldvormingssessie kan een overzichtstablet met lage resolutie (bovenpaneel) de identificatie van de regio(‘s) van belang in de daaropvolgende beeldvormingsdagen vergemakkelijken. Het collageen I-patroon (tweede harmonische generatie, magenta), weefselstructuur en patronen van differentieel gelabelde cellen met fluorescerende eiwitten (afgebeeld in groen, geel en rood) kunnen worden gebruikt om hetzelfde weefselgebied te traceren. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm (overzichtstegelscan) en 100 μm (onderste panelen). (C) Schematische weergave van de R26-Confetti reporter constructie. Bij tamoxifen-geïnduceerde Cre-recombinatie recombineert het confetticonstruct stochastisch, wat resulteert in de expressie van een van de vier fluoroforen (nGFP, YFP, RFP of mCFP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Het openen en sluiten van het deksel van de R.MIW tussen de beeldvormingssessies door Behoud de steriliteit door steriele handschoenen te gebruiken en steriliseer alle items die in contact komen met de muis. Autoclaaf chirurgische hulpmiddelen voorafgaand aan de operatie (zie stap 2 voor details). Zet het verwarmingskussen aan en bedek de mat met een steriel gordijn en verdoof de muis in een inductiekamer met een mengsel van 3% isofluraan/O2 . Controleer voldoende anesthesie door een pootonttrekkingsreflextest uit te voeren. Breng de muis over van de inductiekamer naar een anesthesie neusmasker en verlaag het isofluraangehalte tot 1,5% -2% isofluraan / O2 mengsel. Plaats de uiteinden van een dunne tang door de gaten in de armen van het deksel en maak het deksel los door het deksel tegen de klok in te draaien. Breng indien nodig wat voorverwarmd steriel PBS (37 °C) aan op het raam om het losmaken van het deksel te vergemakkelijken. Plaats het deksel van de R.MIW in een steriele schaal met steriel PBS tot verder gebruik. Reinig de coverglas van het deksel met demi-water en vervolgens 80% ethanol. Bewaar het deksel in steriel PBS tot verder gebruik. Voorkom dat het blootgestelde weefsel uitdroogt door enkele druppels steriel PBS aan het weefseloppervlak toe te voegen. Breng een stof of cellen van belang aan op het blootgestelde weefsel, een maximaal volume van 50 μL kan worden gebruikt. Wacht een paar minuten totdat de vloeistof door het weefsel is opgenomen. Als alternatief kan het weefsel worden gemanipuleerd of geherpositioneerd met behulp van steriele, stompe tangen om de beeldvormingsomstandigheden voor specifieke ROI’s te optimaliseren. Breng vaseline aan op de binnenrand van de R.MIW en zorg ervoor dat u het onderliggende weefsel vermijdt. Plaats het deksel in het R.MIW-frame zoals beschreven in stap 3.9, plaats de uiteinden van een dunne tang door de gaten in de armen van het deksel en draai het deksel vast door het deksel met de klok mee te draaien (ongeveer 5°).