DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi
Summary
DetectSyn, tedaviler veya hastalık durumları arasında göreceli sinaps (sinaptik öncesi ve sonrası) sayısındaki değişiklikleri ölçen tarafsız, hızlı bir floresan testidir. Bu teknik, hem kültürlü nöronlarda hem de sabit dokuda kullanılabilen bir yakınlık ligasyonu tekniği kullanır.
Abstract
Sinapslar, nöronlar arasındaki iletişim yeridir. Nöronal devre gücü sinaptik yoğunluk ile ilişkilidir ve sinapsların parçalanması majör depresif bozukluk (MDB) ve Alzheimer hastalığı gibi hastalık durumlarının karakteristiğidir. Sinaps sayılarını araştırmak için kullanılan geleneksel teknikler arasında floresan belirteçlerin genetik ekspresyonu (örneğin, yeşil floresan proteini (GFP)), bir nöronu dolduran boyalar (örneğin, karbosiyanin boyası, DiI) ve omurga belirteçlerinin immünofloresan tespiti (örneğin, postsinaptik yoğunluk 95 (PSD95)) bulunur. Bu proxy tekniklerine yönelik önemli bir uyarı, yalnızca postsinaptik değişiklikleri tanımlamalarıdır. Yine de, bir sinaps, presinaptik bir terminal ile postsinaptik bir omurga arasındaki bir bağlantıdır. Sinaps oluşumunu/eliminasyonunu ölçmek için altın standart, zaman alan elektron mikroskobu veya dizi tomografisi teknikleri gerektirir. Bu teknikler özel eğitim ve pahalı ekipman gerektirir. Ayrıca, sadece sınırlı sayıda nöron değerlendirilebilir ve tüm beyin bölgesindeki değişiklikleri temsil etmek için kullanılır. DetectSyn, bir hastalık durumu veya ilaç aktivitesi nedeniyle sinaps oluşumundaki veya eliminasyonundaki değişiklikleri tanımlayan hızlı bir floresan tekniğidir. DetectSyn, yan yana yerleştirilmiş ön ve postsinaptik proteinleri ve çoğu laboratuvar için kolayca bulunabilen bir teknik olan standart floresan mikroskopiyi tespit etmek için hızlı bir yakınlık ligasyon testi kullanır. Ortaya çıkan punttanın floresan tespiti, deneylerin hızlı ve tarafsız bir şekilde analiz edilmesini sağlar. DetectSyn, elektron mikroskobundan daha temsili sonuçlar sağlar, çünkü sınırlı sayıda floresan nörondan daha büyük alanlar analiz edilebilir. Dahası, DetectSyn in vitro kültürlü nöronlar ve sabit doku dilimleri için çalışır. Son olarak, bu teknikten toplanan verileri analiz etmek için bir yöntem sağlanmıştır. Genel olarak, DetectSyn, tedaviler veya hastalık durumları arasında sinaps yoğunluğundaki göreceli değişiklikleri tespit etmek için bir prosedür sunar ve geleneksel tekniklerden daha erişilebilirdir.
Introduction
Sinapslar, nöronlar arasındaki iletişimin temel birimidir1. Aynı bölgelerdeki nöronlar arasındaki birçok sinaps, davranışa aracılık eden devrelere yol açar2. Sinapslar, başka bir nöronun postsinaptik reseptörlerine bilgi aktaran nörotransmiterleri veya nöropeptitleri serbest bırakan bir nörondan presinaptik bir terminalden oluşur. Presinaptik sinyallerin toplamı, postsinaptik nöronun bir aksiyon potansiyelini ateşleyip ateşlemeyeceğini ve mesajı diğer nöronlara yayıp yaymayacağını belirler.
Sinapsların parçalanması olan sinaptopatoloji, Alzheimer hastalığı ve majör depresif bozukluk gibi azalmış nöral hacimle işaretlenmiş hastalıklarda ve bozukluklarda ortaya çıkar ve artık en iyi şekilde performans göstermeyen devrelerle sonuçlanır 3,4,5. Sinaps yoğunluğunun geri kazanılması muhtemelen bu bozukluklar için potansiyel tedavilerin etkinliğinin altında yatmaktadır. Örneğin, yakın zamanda artan sinapsların hızlı antidepresanların davranışsal etkinliğinin altında yattığı gösterilmiştir6. Olası sinaptopatoloji tedavilerini hızlı bir şekilde taramak için araştırmacılar, sinaps sayılarındaki değişiklikleri hızlı bir şekilde tanımlayan tekniklere ihtiyaç duyarlar.
Mevcut metodolojiler ya zaman alıcı ve pahalıdır (elektron mikroskobu, dizi tomografisi) ya da presinaptik angajmanı (omurga analizleri, immünofloresan / kolokalizasyon) dahil etmeden sadece postsinaptik değişiklikleri incelerler. DiI gibi boyalar veya GFP gibi floresan proteinler nöronları görselleştirmeye ve postsinaptik dikenleri karakterize etmeye yardımcı olur. Bununla birlikte, omurga analizi, tekrarlanabilirliği azaltabilen morfolojiyi belirlemek için araştırmacı tanımlı oranları kullanır7. Ayrıca, farklı omurga sınıflarının fonksiyonel sinapslarla nasıl ilişkili olduğu hala ortaya çıkarılmaktadır8. Omurga oluşumu geçici olabilir ve postsinaptik plastisiteyi yansıtabilir, ancak bu dikenler presinaptik nöron9 ile bir sinapsa stabilize edilmeden önce elimine edilebilir.
Kolokalizasyon, sinapslar için omurga analizinden daha iyi bir proxy sağlar, çünkü presinaptik ve postsinaptik proteinler için immünoboyayabilir. Bununla birlikte, sinaptik proteinler düşük kolokalizasyon değerleri verebilir, çünkü proteinler yan yana getirilir ve tutarlı bir şekilde örtüşmeyebilir. Bu nedenle, proteinler tamamen üst üste binmediğinden, kolokalizasyon teknikleri, bu eksik bilgi nedeniyle sinaps oluşumundaki değişiklikleri doğru bir şekilde ölçemeyebilir. Son olarak, hem elektron mikroskobu (EM) hem de dizi tomografisi sinapsların yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlasa da, zaman alıcıdır. EM ayrıca özel ekipman gerektirir ve araştırmacılar herhangi bir deney için küçük hacimli dokularla sınırlıdır. Dizi tomografisi, ultra ince kesitlerde birçok proteini zarif bir şekilde tarama yeteneği sağlar ve EM10 ile birleştirilebilirken, bu teknik çok emek yoğun olabilir ve sinaps oluşumundaki değişiklikleri hızlı bir şekilde taraması gereken deneylerin kapsamı dışında olabilir.
DetectSyn, Duolink Proximity Ligation Assay’ın özel bir uygulamasıdır. PLA testi, protein-protein etkileşimlerinin genel tespitine izin verir. DetectSyn, birbirlerinden 40 nm uzaktaki etiketli ön ve son sinaptik proteinler tarafından yayılan bir floresan sinyalini yükselterek proxy postsinaptik ölçümleri köprülemektedir. Eğer sinaptik proteinler sinaptik bir yarık içinde olduğu gibi 40 nm içindeyse, DNA probları içeren ikincil antikorlar dairesel DNA’ya melezleşir. Bu hibridize dairesel DNA, daha sonra standart floresan mikroskopi teknikleriyle güçlendirilen ve tespit edilen bir floresan probu ifade eder (bkz. Şekil 1). En önemlisi, EM ve dizi tomografisinden farklı olarak, bu teknik özel ekipman gerektirmez ve standart immünohistokimya ile aynı miktarda zaman alır. Bu tekniğin erişilebilirliği, araştırma yoğun kurumların dışındaki araştırmacıların sinaptopatoloji araştırmalarına katılmalarını sağlar. Ayrıca, bu teknik, tek bir deneyde birden fazla beyin bölgesindeki sinaptik yoğunluktaki değişiklikleri inceleyebilir ve hastalık veya tedaviye bağlı sinaptik değişikliklerin daha bütünsel bir temsilini sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSyn, birbirlerinden 40 nm uzaklıktaki proteinleri tespit etmek için bir yakınlık ligasyonu testi kullanan ve sinaps oluşumunun tespit edilmesini sağlayan hızlı bir tahlildir. Bu teknik, sinaps oluşumu için sadece vekil ölçümler olarak hizmet veren mevcut floresan tahlillerini geliştirir. DetectSyn, birbirlerinin 40 nm içinde, yani sinaptik yarık içinde lokalize olan sinaptik proteinlerdeki ölçülebilir değişiklikleri tespit eder. Ayrıca, DetectSyn daha uygun maliyetlidir ve sinapsları ölçme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri NINDS R01 NS105005 (KBY) ve NS105005-03S1 (KBY), Savunma Bakanlığı USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KBY), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) ve FRAXA Research (CFH) ve Alzheimer Derneği, AARG-NTF-21-852843 (KBY), AARF-19-614794-RAPID (KBY) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
